एकल कृमि पीसीआर: जीनोमिक डीएनए को निकालने और बढ़ाने के लिए एक विधि

Overview

इस वीडियो को तेजी से पीसीआर स्क्रीनिंग द्वारा एक आनुवंशिक मार्कर के लिए एक ही सूत्रकृमि स्क्रीन करने के लिए एक तकनीक का वर्णन करता है । उदाहरण प्रोटोकॉल में, हम CRISPR-आधारित जीनोम संपादन के लिए स्क्रीन करते हैं।

Protocol

निम्नलिखित प्रोटोकॉल पूर्व एट अल, सी एलिगेंस में जीनोमिक पॉइंट म्यूटेंट उत्पन्न करने के लिए एक त्वरित और फेसियल पाइपलाइन का एक अंश है जो CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins, जे विस Expका उपयोग कर रहा है। (2018).

सिंगल वर्म पीसीआर और जेनोटीपिंग

1. अंडे बिछाने के 1 - 2 दिनों के बाद, एफ₁एस को अलग-अलग पीसीआर स्ट्रिप ट्यूब कैप में स्थानांतरित करें जिसमें वर्म लाइसिस बफर के 7 माइक्रोन एक कृमि पिक(टेबल 1, चित्रा 1D,दिन 4 - 5) का उपयोग करके किया जाता है।
2. ट्यूब के नीचे जानवरों को लाने के लिए कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए अधिकतम गति से अपकेंद्रित्र पीसीआर ट्यूब, और 1 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब फ्रीज।
   नोट: कीड़े को अनिश्चित काल के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
3. निम्नलिखित कार्यक्रम का उपयोग करके थर्मोसाइकिलर में Lyse जमे हुए कीड़े: 60 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस, 15 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, 4 डिग्री सेल्सियस होल्ड।
4. सेट-अप पीसीआर मास्टरमिक्स जैसा कि तालिका 2में दिखाया गया है।
5. पीसीआर मास्टरमिक्स के 21 माइक्रोन को साफ पीसीआर ट्यूब में डालें, और फिर स्टेप 3 से 4 माइक्रोन वर्म लाइसिस जोड़ें। एक पिपेट का उपयोग करके अच्छी तरह से मिलाएं और निर्माताओं के दिशानिर्देशों का पालन करते हुए पीसीआर प्रोग्राम चलाएं (सामग्री तालिकादेखें)।
6. निर्माता निर्देशों का पालन करते हुए डीएनए क्लीन एंड कॉन्सेंट्रेट किट का उपयोग करके पीसीआर प्रतिक्रियाओं को शुद्ध करें (सामग्री तालिकादेखें)। स्पिन कॉलम में 10 माइक्रोन पानी जोड़कर एल्यूट डीएनए।
7. सेट-अप प्रतिबंध एंजाइम मास्टरमिक्स जैसा कि तालिका 3में दिखाया गया है।
8. प्रत्येक साफ पीसीआर प्रतिक्रिया में प्रतिबंध एंजाइम मास्टरमिक्स के 10 माइक्रोन जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 - 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
9. 1.5% एगर उठे जेल पर अलग-अलग पचाने वाले पीसीआर उत्पाद 1x ट्रिज़-एसीटेट-ईडीटीए (टीएई) बफर का उपयोग करके 120 वी पर चलते हैं।

Representative Results

चित्रा 1. सीएलिगेंसोड-1 लोकस की CRISPR-Cas9 इंजीनियरिंग। (क)योजनाबद्ध दृष्टांत सी एलिगेंसमें सोड-1 लोकस की एक्सॉन-इंट्रोन संरचना को दर्शाता है । लाल पट्टी exon 3 में G93 के स्थान को दर्शाता है । प्राइमर जोड़ी सेट लाल तीर (F1-R1) द्वारा विख्यात है । (B)मानव और सी एलिगेंस (कृमि) एसओडी-1 प्रोटीन का अनुक्रम संरेखण। लक्षित G93 अवशेषों को लाल रंग में हाइलाइट किया गया है। (ग) शीर्ष,G93 codon आसपास जीनोमिक डीएनए का एक वर्ग एक संदर्भ के रूप में दिखाया गया है, और पाम (ग्रीन) और sgRNA लक्ष्य (नीला) साइटों पर प्रकाश डाला जाता है । नीचे,एकल फंसे ओलिगोन्यूक्लियोटाइड (ssODN) होमोलॉजी निर्देशित मरम्मत (एचडीआर) टेम्पलेट को युक्त दिखाया गया है: कोडन एडिट G93 को A93 में बदल रहा है, SgRNA-Cas9 परिसर द्वारा दरार को रोकने के लिए पाम मोटिफ में एक मूक परिवर्तन, एक अद्वितीय हिंदआईआई एंजाइम साइट (पीला बॉक्स) शुरू करने के लिए एक मूक परिवर्तन, और 5 ' और 3 ' 50 ' बीपी होम आर्म्सोलॉजी (ब्लैक बार) । एसएसओडीएन में डिजाइन किए गए सभी न्यूक्लियोटाइड परिवर्तनों को लाल रंग से हाइलाइट किया गया है। (घ)CRISPR-Cas9 आरएनपी आधारित बिंदु म्यूटेंट के उत्पादन और पहचान के लिए पाइपलाइन का योजनाबद्ध चित्रण । 0 दिन पर, इंजेक्शन मिश्रण के साथ 10 -15 पी₀ जानवरों को इंजेक्ट करें। दिन 2 - 3 पर, फ्लोरोसेंट एफ₁ संतान वाले लोगों द्वारा सफलतापूर्वक पी₀ जानवरों की पहचान करें, और सबसे फ्लोरोसेंट संतान के साथ तीन पी₀ प्लेटों का चयन करें। तीन पी₀ प्लेटों में से प्रत्येक से, एकल 8 फ्लोरोसेंट एफ₁ संतान। दिन 4 - 5, (क) चरण 1, व्यक्तिगत एफ₁एस को चुना जाता है और लाइसिस बफर युक्त पीसीआर ट्यूबों में रखा जाता है; (ख) स्टेप 2, -80 डिग्री सेल्सियस पर ठंड के बाद, एफ₁ कीड़े वाली पीसीआर ट्यूबों को जीनोमिक डीएनए जारी करने के लिए लिस किया जाता है, जिसका उपयोग पीसीआर टेम्पलेट के रूप में किया जाता है। पीसीआर उत्पादों को तब अद्वितीय प्रतिबंध एंजाइम के साथ साफ और पचा दिया जाता है; (ग) चरण 3, एंजाइम पचाने वाले उत्पादों को एक एगरेग्ग्राइल पर हल किया जाता है जहां जंगली प्रकार (+/+), विषम (एम/+), और समोसे (एम/एम) जानवरों की पहचान प्रतिबंध डाइजेस्ट बैंडिंग पैटर्न द्वारा की जा सकती है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें । 

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ)	[अंतिम]
केसीएल	50mm
ट्रिस-एचसीएल पीएच 8.3	10 mm
एमजीसीएल2	2.5 mM
एनपी-40	0.45%
ट्वीन-20	0.45%
प्रोटीनेज कश्मीर	1 मिलीग्राम/एमएल

तालिका 1. कृमि लाइसिस बफर नुस्खा। प्रत्येक उपयोग से पहले प्रोटीनेज कश्मीर को ताजा जोड़ा जाना चाहिए।

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ)	1x	24x
2X Q5 मास्टरमिक्स	12.5 माइक्रोल	300 माइक्रोल
प्राइमर F1 (10 माइक्रोन)	1.25 माइक्रोल	30 माइक्रोन
प्राइमर R1 (10 माइक्रोन)	1.25 माइक्रोल	30 माइक्रोन
कृमि लाइसिस	4 माइक्रोन	----
ddH2O	6 माइक्रोन	144 माइक्रोल
अंतिम मात्रा	25 माइक्रोन	504 माइक्रोल

तालिका 2. पीसीआर मास्टरमिक्स। पीसीआर मास्टरमिक्स को तब तक पाइपिंग करके अच्छी तरह से मिलाया जाना चाहिए जब तक कि समाधान सजातीय न हो जाए। पीसीआर मास्टरमिक्स के 21 माइक्रोन को साफ पीसीआर ट्यूबों में जोड़ा जाना चाहिए, और फिर 4 माइक्रोन व्यक्तिगत कृमि lysate को ठीक से लेबल वाली ट्यूबों में जोड़ा जाना चाहिए।

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ)	1x	24x
10X एंजाइम बफर	2 माइक्रोन	48 माइक्रोन
साफ पीसीआर रिएक्शन	10 माइक्रोल	----
ddH2O	7 माइक्रोन	168 माइक्रोल
प्रतिबंध एंजाइम (10 U/μL)	1 माइक्रोल	24 माइक्रोन
अंतिम मात्रा	20 माइक्रोन	240 माइक्रोल

तालिका 3. प्रतिबंध एंजाइम मास्टरमिक्स। जब तक समाधान सजातीय न हो तब तक प्रतिबंध एंजाइम मास्टरमिक्स को पाइपिंग करके अच्छी तरह से मिलाया जाना चाहिए। प्रतिबंध एंजाइम मास्टरमिक्स के 10 माइक्रोन को साफ पीसीआर उत्पाद के 10 माइक्रोन में जोड़ा जाना चाहिए।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nuclease-free water	Synthego Inc.	provided with the sgRNA kit EZ kit
KCl	Sigma	P5405
DNA Clean & Concentrator	Zymo Research	D4004
Zymoclean Gel DNA Recovery Kit	Zymo Research	D4002
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix	New England Biolabs	M0494L
Proteinase K	Sigma	P2308
MgCl2	Sigma	M2393
NP-40	Sigma	74385
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-100
RNaseZap Decontamination Solution	Fisher Scientific	AM9780