Overview
Bu video, akut toksisite için bir tedaviyi test eden veya toksik bir duruma direnç için genetik bir suşu test eden kısa süreli bir sağkalım testi sunar. Örnek protokol, solucanların paraquat (PQ) tarafından indüklenen oksidatif strese karşı koyma yetenekleri için test edildiği örnek bir hayatta kalma testi gösterir.
Protocol
Bu protokol, 96 kuyulu Mikrotiter Plakalarda Caenorhabditis eleganlarının Oksidatif Stres Direncini Ölçen Possikve Pause'tan bir alıntıdır, J. Vis. Exp. (2015).
1. Oksidatif Stres Direnci Tahlilinin Gerçekleştirilmesi
- Pipet 40 μl 100 mM PQ çözeltisi (taze hazırlanmış) 96 kuyu plakasının her kuyusuna. Her durumun (tedavi, mutant vb.)çoğaltılması için en az 12 kuyu kullanın. Platin tel solucanı seçimi kullanarak, başlangıç zamanını ve bitiş saatini gösteren her kuyuya 5-8 L4 larva hayvanı aktarın.
- Başka bir koşulu başlatırken, başlangıç saatini ve bitiş saatini not edin. Plakayı, solucanların aktarılması ve ölü hayvanların başlangıç saatinden bir saat sonra puanlanması arasındaki kuluçka süresine 20 °C'ye yerleştirin.
- Diseksiyon mikroskobu kullanarak, her saat hayatta kalmayı sayın. Saymaya başlamadan önce tabağı hafifçe sallayın. Yüksek yoğunluklu bir ışığı tespit ettikten sonra bile hareket etmeyen solucanları ölü hayvanlar olarak belirtin. Ayrıca canlı hayvan sayısını da belirtin.
NOT: Solucan şekline, kuyruklarına ve kafa hareketine yüksek büyütmede bakmak, ölü solucanların canlı olarak belirlenmesine yardımcı olur. - Çoğu solucan ölene kadar bu adımı her saat tekrarlayın.
2. Her Zaman Noktasında Hayatta Kalma Yüzdesinin Belirlenmesi
- Her kuyuya aktarılan toplam hayvan sayısını ekleyerek durum başına toplam hayvan sayısını hesaplayın. Transfer sırasında zarar gören veya öldürülen hayvanları görmezden gelin.
- Her zaman noktası için, durum başına toplam ölü hayvan sayısını hesaplayın (12 kuyudaki ölü hayvanların toplamı). Her zaman noktası için, ölüm yüzdesini (ölü hayvan sayısı toplam hayvan sayısına bölünür ve 100 ile çarpılır) ve hayatta kalma yüzdesini (yüzde 100 eksi ölüm) hesaplayın.
- Bu tahlil en az 3 bağımsız kez tekrarlayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Discovery v8 stereo zeiss microscope | Zeiss | ||
| 96 well clear microtiter plate |
