Overview
Este vídeo introduz um ensaio de sobrevivência de curto prazo que testa um tratamento para toxicidade aguda ou testa uma cepa genética para resistência a uma condição tóxica. O protocolo de exemplo mostra um exemplo de ensaio de sobrevivência no qual os vermes são testados para sua capacidade de resistir ao estresse oxidativo induzido pelo paraquat (PQ).
Protocol
Este protocolo é um trecho de Possik and Pause, Medindo a Resistência ao Estresse Oxidativo de Caenorhabditis elegans em placas de microtiter de 96 poços, J. Vis. Exp. (2015).
1. Executando o ensaio de resistência ao estresse oxidativo
- Pipeta 40 μl da solução PQ de 100 mM (preparada fresca) para cada poço de uma placa de 96 poços. Use pelo menos 12 poços como réplicas de todas as condições (tratamento, mutante, etc.). Usando uma picareta de vermisão de fio de platina, transfira 5-8 animais larvas L4 para cada poço indicando o tempo de início e o tempo final.
- Ao iniciar outra condição, observe a hora de início e o tempo final. Coloque a placa a 20 °C no tempo de incubação entre transferir os vermes e marcar animais mortos uma hora depois do horário de início.
- Usando o microscópio de dissecação, conte a sobrevivência a cada hr. Agite suavemente a placa antes de começar a contar. Indique vermes que não se movem, mesmo depois de detectar uma luz de alta intensidade, como animais mortos. Também indique o número de animais vivos.
NOTA: Olhando para a forma de verme, caudas e movimento da cabeça em alta ampliação, ajudar a determinar vermes mortos de vivos. - Repita este passo a cada hora até que a maioria dos vermes estejam mortos.
2. Determinação da Porcentagem de Sobrevivência em Cada Ponto de Tempo
- Calcule o número total de animais por condição adicionando o número total de animais transferidos para cada poço. Ignore os animais que são danificados ou mortos após a transferência.
- Para cada ponto de tempo, calcule o número total de animais mortos por condição (soma de animais mortos nos 12 poços). Para cada ponto de tempo, calcule a porcentagem de óbitos (número de animais mortos dividido pelo número total de animais e multiplicado por 100) e percentual de sobrevivência (100 menos por cento de morte).
- Repita este ensaio pelo menos 3 vezes independentes.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Discovery v8 stereo zeiss microscope | Zeiss | ||
| 96 well clear microtiter plate |
