Overview
Denne video introducerer en kortsigtet overlevelsesanalyse, der tester en behandling for akut toksicitet eller tester en genetisk stamme for resistens over for en giftig tilstand. Eksempelprotokollen viser et eksempel på overlevelsesanalyse, hvor orme testes for deres evne til at modstå oxidativ stress forårsaget af paraquat (PQ).
Protocol
Denne protokol er et uddrag fra Possik og Pause, Måling Oxidativ stressresistens af Caenorhabditis elegans i 96-brønd Microtiter Plates, J. Vis. Exp. (2015).
1. Udførelse af Oxidative Stress Resistance Assay
- Pipette 40 μl af 100 mM PQ opløsning (tilberedt frisk) til hver brønd af en 96 brønd plade. Brug mindst 12 brønde som replikater af alle tilstande (behandling, mutant osv.). Ved hjælp af en platintråd orm pick, overføre 5-8 L4 larver dyr til hver brønd angiver starttidspunkt og sluttidspunkt.
- Når du starter en anden betingelse, skal du notere starttidspunktet og sluttidspunktet. Pladen anbringes ved 20 °C i inkubationstiden mellem overførsel af ormene og scoring af døde dyr en time senere fra starttidspunktet.
- Brug dissekere mikroskop, tælle overlevelse hver hr. Ryst forsigtigt pladen, før du begynder at tælle. Angiv orme, der ikke bevæger sig, selv efter at have spottet et højintensivt lys, som døde dyr. Angiv også antallet af dyr i live.
BEMÆRK: Ser man på orm form, haler og hoved bevægelse ved høj forstørrelse, hjælpe med at bestemme døde orme fra live. - Gentag dette trin hver time, indtil de fleste orme er døde.
2. Bestemmelse af overlevelsesprocent ved hvert tidspunkt
- Beregn det samlede antal dyr pr. tilstand ved at tilføje det samlede antal dyr, der overføres til hver brønd. Ignorer de dyr, der er beskadiget eller dræbt ved overførsel.
- For hvert tidspunkt beregnes det samlede antal døde dyr pr. tilstand (summen af døde dyr i de 12 brønde). For hvert tidspunkt beregnes procentdelen af dødsfald (antal døde dyr divideret med det samlede antal dyr og ganget med 100) og procentdelen af overlevelse (100 minus procent død).
- Gentag denne analyse mindst 3 uafhængige gange.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Discovery v8 stereo zeiss microscope | Zeiss | ||
| 96 well clear microtiter plate |
