C. elegans Test di sopravvivenza: un test di tossicità a breve termine

Overview

Questo video introduce un saggio di sopravvivenza a breve termine che testa un trattamento per la tossicità acuta o testa un ceppo genetico per la resistenza a una condizione tossica.  Il protocollo di esempio mostra un esempio di test di sopravvivenza in cui i vermi vengono testati per la loro capacità di resistere allo stress ossidativo indotto dal paraquat (PQ).

Protocol

Questo protocollo è un estratto da Possik and Pause, Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates, J. Vis. Exp.

1. Esecuzione del saggio di resistenza allo stress ossidativo

1. Pipetta 40 μl della soluzione PQ da 100 mM (preparata fresca) ad ogni pozzo di una piastra da 96 pozza. Utilizzare almeno 12 pozzi come repliche di ogni condizione (trattamento, mutante, ecc.). Utilizzando un piccone di verme filo di platino, trasferire 5-8 animali larve L4 in ogni pozzo indicando l'ora di inizio e l'ora di fine.
2. Quando si avvia un'altra condizione, prendere nota dell'ora di inizio e dell'ora di fine. Posizionare la piastra a 20 °C nel tempo di incubazione tra il trasferimento dei vermi e il punteggio di animali morti un'ora dopo dall'ora di inizio.
3. Usando il microscopio sezionato, contare la sopravvivenza ogni ora. Agitare delicatamente la piastra prima di iniziare a contare. Indica i vermi che non si muovono, anche dopo aver avvistare una luce ad alta intensità, come animali morti. Indica anche il numero di animali vivi.
   NOTA: Osservando la forma del verme, le code e il movimento della testa ad alto ingrandimento, aiuta a determinare i vermi morti da vivi.
4. Ripeti questo passaggio ogni ora fino a quando la maggior parte dei vermi non è morta.

2. Determinazione della percentuale di sopravvivenza in ogni punto di tempo

1. Calcola il numero totale di animali per condizione aggiungendo il numero totale di animali trasferiti ad ogni pozzo. Ignora gli animali danneggiati o uccisi al momento del trasferimento.
2. Per ogni momento, calcola il numero totale di animali morti per condizione (somma degli animali morti nei 12 pozzi). Per ogni punto di tempo, calcola la percentuale di morte (numero di animali morti divisi per numero totale di animali e moltiplicati per 100) e la percentuale di sopravvivenza (100 meno la morte).
3. Ripetere questo saggio almeno 3 volte indipendenti.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Discovery v8 stereo zeiss microscope	Zeiss
96 well clear microtiter plate