Ensaio eletrotaxista: um método para observar a locomoção em C. elegans

Overview

Os pesquisadores podem desencadear movimento sob demanda em C. elegans aplicando um campo elétrico que os vermes sentem e respondem.  Este vídeo introduz o comportamento eletrotático e mostra um protocolo amostral que é feito em um dispositivo microfluido.

Protocol

Este protocolo é um trecho de Tong et al,Eletrotaxis baseado em microfluidic para análise quantitativa sob demanda da Locomoção de Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2013). 

1. Experimento de Eletrotaxis

1. Coloque o microcanal no palco (preferencialmente XY-móvel) de um microscópio com uma câmera montada conectada a um monitor(Figura 1).
2. Conecte a fonte de alimentação ou os fios de saída do amplificador aos eletrodos do microcanal. Uma simples fonte de alimentação DC é suficiente se apenas um sinal DC for desejado, mas um amplificador conectado a um gerador de função permite a aplicação de sinais DC e AC pulsados também.
3. Conecte o tubo de saída do microcanal a uma seringa descartável. Submergir a boca do tubo de entrada no tampão fisiológico M9 e aspirar suavemente líquido no canal, aplicando uma pressão negativa dentro da seringa (manualmente ou usando uma bomba de seringa). Quando os tubos de entrada e saída estiverem cheios de M9, desconecte a seringa do tubo. Nivele ambos os tubos à mesma altura para evitar o fluxo hidroesticamente conduzido.
4. Aplique uma tensão DC no canal e certifique-se de que a resistência (R= V/I) seja em torno de 0,6 MΩ (para um microchannel de 50 mm de comprimento, 0,3 mm de largura e ~0,1 mm de profundidade).
5. Se estiver satisfeito com a integridade do canal, siga as etapas acima para carregar worms de uma suspensão diluída no canal.
6. Desconectar a seringa e manipular hidrostaticamente o fluxo ajustando a altura relativa dos tubos. Use este método para colocar um verme no centro do canal e, em seguida, coloque ambos os tubos planos na mesma elevação.
7. Defina a fonte de alimentação para a tensão apropriada: 4-12 V/cm para animais de estágio L3, 4-10 V/cm para L4s e 2-4 V/cm para adultos jovens. Ative o sinal elétrico e permita que 1 min de pré-exposição para o verme se aclimatarem ao campo. O verme deve começar a se mover em direção ao cátodo. Quando o minuto passar, use a câmera para começar a gravar.
8. Para experimentos CA e DC pulsados, o campo elétrico máximo responsivo pode ser adotado de cima e o ciclo de frequência e dever do sinal pode ser modulado conforme desejado.
9. Quando o experimento estiver concluído, remova todo o líquido (e vermes) do canal, enxágue-o com dH₂₀e deixe o dispositivo em uma placa quente a 125 °C para secar.
10. Extrair dados locomotórios de vídeos gravados manualmente usando o NIH ImageJ(http://rsbweb.nih.gov/ij/) ou software personalizado de rastreamento de worms baseado em MATLAB.

Representative Results

Figura 1. Esquema de plataforma de triagem microfluidic para ensaio de eletrotáxi de nematoide.