紫外线照射：集成染色体外阵列的方法

Overview

转基因的微注入通常会导致 C.elegans 菌株与大型染色体外阵列，这导致转基因的可变表达和传输。 紫外线照射可以诱导阵列的染色体整合和更稳定的转基因传输。

Protocol

本协议摘自Mariol等人，一个快速协议集成外染色体阵列与高传输率到C.elegans基因组，J.Vis.Exp.（2013年）。 

1. 紫外线照射和转基因蠕虫的恢复

1. 蠕虫辐照：
   1. 将30-100种荧光转基因L4动物挑选到单独的培养板上（按板分列15-20只动物）。
   2. 将板材（盖子取下）放在紫外线交叉链接器中。以0.012 J/cm²辐射蠕虫。请注意，菌株对紫外线或多或少敏感，结果可能因使用的紫外线辐照器而异。可测试 0.010-0.015 J/cm²之间的剂量范围。
2. 辐照后蠕虫恢复：
   1. 将带辐照蠕虫的盘子放置在 15 °C 过夜，以进行恢复。
   2. 检查活着的动物数量。在我们手中，大约80-90%的存活率被适应高效的辐照。
   3. 在 15-25 °C 时将辐照动物生长，直到后代达到发育阶段，从而观察投币标记表达。

2. 集成转基因线的隔离

1. 选择F1动物：
   1. 单150-200荧光F1动物到单独的文化板。对于高传输线（≥80%），100只F1动物就足够了。
   2. 将这些 F1 板保持在 15-25 °C，直到后代达到观察荧光 F2 动物的适当阶段。
   3. 丢弃所有展示i）无后代的 F1 车牌，表示 F1 动物无菌或死亡，或ii）没有或只有少数荧光 F2 动物，表示 F1 动物没有以预期的速度传输转基因。这一步是快速的，并代表一个真正的优势相比，标准协议，要求估计荧光F2蠕虫的百分比，以选择F1板显示≥75%荧光后代（表1）。
2. F2 动物的选择：
   1. 从每个选定的F1板单四个荧光转基因F2动物。当使用荧光转基因（例如mCherry、gfp或dsRed）时，选择荧光水平高的F2蠕虫，因为这可能表明这些动物是集成阵列的同酶。请注意，在挑选 F2 动物时，必须不要携带卵子或幼虫，以避免下一步出现假阴性。
   2. 在 15-25 °C 下种植 F2 动物。
3. 集成转基因菌株的隔离和验证：
   1. 屏幕 F2 板 100% 荧光转基因 F3 蠕虫。屏幕是相当快速的，因为存在一个单一的无荧光蠕虫表明，板应该扔掉。一种F2动物同源的集成转基因将给100%同源荧光后代。
   2. 单8个荧光F3动物从选定的板，以确认转基因的100%继承。从理论上讲，在这一步中挑选一种动物就足够了。然而，挑选八种荧光F3动物可能是必要的，以避免选择不育或不健康的动物，因为辐照可以随机诱发突变，影响对蠕虫生理学很重要的基因。
   3. 如果可能，保留几个独立的集成转基因菌株，即从不同的F1动物中恢复的菌株。

Representative Results

表1。比较标准和改进的协议，将染色体外阵列集成到 C.elegans 基因组中。使用标准或改进的协议集成了两个以相同频率传输的非集成转基因。主要区别在于，在标准协议中，执行所有F1车牌上后代的屏幕来估计转基因F2蠕虫的百分比，这应该≥75%。这一步骤需要很长时间，特别是如果初始传输速率接近 75%。在改进后的协议中，它足以从每个携带转基因F2动物的F1板中单个四个F2蠕虫，并筛选出后代（F3）中100%的转基因蠕虫，这些蠕虫可以快速执行。标准协议已调整。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
U.V. cross-linker	Fischer Scientific		Wavelength 254 nm
Microscope SteREO Discovery V8	Carl Zeiss, Inc.
Petri dishes, 60 mm	CML	BPS55E6
Platinium wire 0.25 mm	Alfa Aesar	6/4/7440	To make a pick for worms