Overview
转基因的微注入通常会导致 C.elegans 菌株与大型染色体外阵列,这导致转基因的可变表达和传输。 紫外线照射可以诱导阵列的染色体整合和更稳定的转基因传输。
Protocol
本协议摘自Mariol等人,一个快速协议集成外染色体阵列与高传输率到C.elegans基因组,J.Vis.Exp.(2013年)。
1. 紫外线照射和转基因蠕虫的恢复
- 蠕虫辐照:
- 将30-100种荧光转基因L4动物挑选到单独的培养板上(按板分列15-20只动物)。
- 将板材(盖子取下)放在紫外线交叉链接器中。以0.012 J/cm2辐射蠕虫。请注意,菌株对紫外线或多或少敏感,结果可能因使用的紫外线辐照器而异。可测试 0.010-0.015 J/cm2之间的剂量范围。
- 辐照后蠕虫恢复:
- 将带辐照蠕虫的盘子放置在 15 °C 过夜,以进行恢复。
- 检查活着的动物数量。在我们手中,大约80-90%的存活率被适应高效的辐照。
- 在 15-25 °C 时将辐照动物生长,直到后代达到发育阶段,从而观察投币标记表达。
2. 集成转基因线的隔离
- 选择F1动物:
- 单150-200荧光F1动物到单独的文化板。对于高传输线(≥80%),100只F1动物就足够了。
- 将这些 F1 板保持在 15-25 °C,直到后代达到观察荧光 F2 动物的适当阶段。
- 丢弃所有展示i)无后代的 F1 车牌,表示 F1 动物无菌或死亡,或ii)没有或只有少数荧光 F2 动物,表示 F1 动物没有以预期的速度传输转基因。这一步是快速的,并代表一个真正的优势相比,标准协议,要求估计荧光F2蠕虫的百分比,以选择F1板显示≥75%荧光后代(表1)。
- F2 动物的选择:
- 从每个选定的F1板单四个荧光转基因F2动物。当使用荧光转基因(例如mCherry、gfp或dsRed)时,选择荧光水平高的F2蠕虫,因为这可能表明这些动物是集成阵列的同酶。请注意,在挑选 F2 动物时,必须不要携带卵子或幼虫,以避免下一步出现假阴性。
- 在 15-25 °C 下种植 F2 动物。
- 集成转基因菌株的隔离和验证:
- 屏幕 F2 板 100% 荧光转基因 F3 蠕虫。屏幕是相当快速的,因为存在一个单一的无荧光蠕虫表明,板应该扔掉。一种F2动物同源的集成转基因将给100%同源荧光后代。
- 单8个荧光F3动物从选定的板,以确认转基因的100%继承。从理论上讲,在这一步中挑选一种动物就足够了。然而,挑选八种荧光F3动物可能是必要的,以避免选择不育或不健康的动物,因为辐照可以随机诱发突变,影响对蠕虫生理学很重要的基因。
- 如果可能,保留几个独立的集成转基因菌株,即从不同的F1动物中恢复的菌株。
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Representative Results
表1。比较标准和改进的协议,将染色体外阵列集成到 C.elegans 基因组中。使用标准或改进的协议集成了两个以相同频率传输的非集成转基因。主要区别在于,在标准协议中,执行所有F1车牌上后代的屏幕来估计转基因F2蠕虫的百分比,这应该≥75%。这一步骤需要很长时间,特别是如果初始传输速率接近 75%。在改进后的协议中,它足以从每个携带转基因F2动物的F1板中单个四个F2蠕虫,并筛选出后代(F3)中100%的转基因蠕虫,这些蠕虫可以快速执行。标准协议已调整。
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
U.V. cross-linker | Fischer Scientific | Wavelength 254 nm | |
Microscope SteREO Discovery V8 | Carl Zeiss, Inc. | ||
Petri dishes, 60 mm | CML | BPS55E6 | |
Platinium wire 0.25 mm | Alfa Aesar | 6/4/7440 | To make a pick for worms |