UV-bestråling: En metode til integrering af ekstrakromosomale arrays

Overview

Mikroinjektion af transgener resulterer normalt i C. elegans stammer med store ekstrakromosomale arrays, hvilket resulterer i variabelt udtryk og transmission af transgenet.  UV-bestråling kan fremkalde kromosomal integration af array og mere stabil transgene transmission.

Protocol

Denne protokol er et uddrag fra Mariol et al, en hurtig protokol til integration af ekstrakromosomale arrays med høj transmissionshastighed i C. elegans Genome, J. Vis. Exp. (2013).

1. UV-bestråling og genvinding af transgene orme

1. Bestråling af orme:
   1. Vælg 30-100 fluorescerende transgene L4-dyr på separate dyrkningsplader (15-20 dyr med tallerken).
   2. Placer pladerne, med lågene fjernet, i en UV cross-linker. Bestråling af ormene ved 0,012 J/cm². Bemærk, at stammer er mere eller mindre følsomme over for UV, og at resultaterne kan variere afhængigt af den anvendte UV-bestrålingsmotor. Et dosisområde på mellem 0,010-0,015 J/cm² kan testes.
2. Generhvervelse af orme efter bestråling:
   1. Placer plader med bestrålede orme natten over ved 15 °C for at komme sig.
   2. Tjek for antallet af dyr, der er i live. I vores hænder er en overlevelsesrate på omkring 80-90% tilpasset til en effektiv bestråling.
   3. De bestrålede dyr dyrkes ved 15-25 °C, indtil afkomet har nået udviklingsstadiet, så udtrykket for møntmarkøren kan iagttages.

2. Isolering af integrerede transgene linjer

1. Udvælgelse af F1-dyr:
   1. Enkelt 150-200 fluorescerende F1 dyr på separate kulturplader. For stærkt transmitterende linjer (≥80%), er 100 F1 dyr nok.
   2. Disse F1-plader opbevares ved 15-25 °C, indtil afkomet når et passende stadium til observation af fluorescerende F2-dyr.
   3. Alle F1-plader, der udviser enten i) intet afkom, hvilket tyder på, at F1-dyret var sterilt eller døde, eller ii) ingen eller kun få fluorescerende F2-dyr, hvilket tyder på, at F1-dyret ikke transmitterede transgenet med den forventede hastighed. Dette trin er hurtigt og repræsenterer en reel fordel sammenlignet med standardprotokollen, der kræver et skøn over procentdelen af fluorescerende F2-orme for at vælge F1-plader, der udviser ≥75% fluorescerende afkom (Tabel 1).
2. Udvælgelse af F2-dyr:
   1. Enkelt fire fluorescerende transgene F2 dyr fra hver udvalgt F1 plade. Når du bruger fluorescerende transgener (for eksempel mCherry, gfp eller dsRed), skal du vælge F2-orme med et højt niveau af fluorescens, da dette kan indikere, at disse dyr er homozygogous for det integrerede array. Bemærk, at når man plukker F2-dyr, er det vigtigt ikke at bære æg eller larver for at undgå falske negativer i næste trin.
   2. F2-dyr dyrkes ved 15-25 °C.
3. Isolering og validering af integrerede transgene stammer:
   1. Skærm F2 plader til 100% fluorescerende transgene F3 orme. Skærmen er ret hurtig, da tilstedeværelsen af en enkelt ikke-fluorescerende orm indikerer, at pladen skal smides væk. En F2 dyr homozygous for den integrerede transgene vil give 100% homozygous fluorescerende afkom.
   2. Enkelt otte fluorescerende F3 dyr fra udvalgte plader for at bekræfte 100% arv af transgenet. I teorien er det nok at vælge et dyr på dette trin. Det kan dog være nødvendigt at plukke otte fluorescerende F3-dyr for at undgå at vælge ufrugtbare eller usunde dyr, da bestråling tilfældigt kan fremkalde mutationer, der påvirker gener, der er vigtige for ormens fysiologi.
   3. Hvis det er muligt, skal der holdes flere uafhængige integrerede transgene stammer, dvs. stammer genvundet fra forskellige F1-dyr.

Representative Results

Tabel 1. Sammenligning af standardprotokollerne og forbedrede protokoller for integration af ekstrakromosomale arrays iC. elegans-genomet. To ikke-integrerede transgener, der transmitterede med omtrent samme frekvens, blev integreret ved hjælp af standarden eller den forbedrede protokol. Den største forskel ligger i det faktum, at der i standardprotokollen udføres en skærm af afkom på alle F1-plader for at estimere procentdelen af transgene F2-orme, som skal være ≥ 75%. Dette skridt tager lang tid, især hvis den oprindelige transmissionshastighed er tæt på 75%. I den forbedrede protokol er det tilstrækkeligt at enkelt fire F2 orme fra hver F1 plade transporterer transgene F2 dyr og til at screene for 100% af transgene orme i afkom (F3), som kan udføres hurtigt. Standardprotokollen er tilpasset.  

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
U.V. cross-linker	Fischer Scientific		Wavelength 254 nm
Microscope SteREO Discovery V8	Carl Zeiss, Inc.
Petri dishes, 60 mm	CML	BPS55E6
Platinium wire 0.25 mm	Alfa Aesar	6/4/7440	To make a pick for worms