यूवी विकिरण: एक्स्ट्राक्रोमोमोमल एरे को एकीकृत करने की एक विधि

Overview

ट्रांसजीन के माइक्रोइंजेक्शन के परिणामस्वरूप आमतौर पर बड़े एक्सट्राक्रोमोमोमल सरणी के साथ सी एलिगेंस उपभेदों का परिणाम होता है, जिसके परिणामस्वरूप ट्रांसजीन की चर अभिव्यक्ति और संचरण होता है।  यूवी विकिरण सरणी और अधिक स्थिर ट्रांसजीन ट्रांसमिशन के गुणसूत्र एकीकरण को प्रेरित कर सकता है।

Protocol

यह प्रोटोकॉल मारियोल एट अल का एक अंश है,जो सी एलिगेंस जीनोम, जे विस एक्सपी (2013) में उच्च पारेषण दर के साथ एक्स्ट्राक्रोमोमोमल ऐरे को एकीकृत करने के लिए एक त्वरित प्रोटोकॉल है। 

1. ट्रांसजेनिक वर्म्स की यूवी विकिरण और रिकवरी

1. कृमि विकिरण:
   1. अलग संस्कृति प्लेटों (प्लेट द्वारा 15-20 जानवरों) पर 30-100 फ्लोरोसेंट ट्रांसजेनिक L4 जानवरों उठाओ ।
   2. प्लेटों को हटाया ढक्कन के साथ, एक यूवी क्रॉस-लिंकर में रखें। 0.012 J/सेमी²पर कीड़े विकिरण । ध्यान दें कि उपभेदों कम या ज्यादा यूवी के प्रति संवेदनशील हैं और यह परिणाम यूवी विकिरण के आधार पर उपयोग किए जाते हैं। 0.010-0.015 J/सेमी² के बीच एक खुराक सीमा का परीक्षण किया जा सकता है ।
2. विकिरण के बाद कीड़ा वसूली:
   1. वसूली के लिए 15 डिग्री सेल्सियस पर रात भर किरणित कीड़े के साथ प्लेटें रखें।
   2. जीवित जानवरों की संख्या की जांच करें। हमारे हाथों में, लगभग 80-90% की जीवित रहने की दर एक कुशल विकिरण के लिए अनुकूलित है।
   3. विकिरणित जानवरों को 15-25 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ाएं जब तक कि संतान विकास के चरण तक नहीं पहुंच जाए, जो कॉइनजेक्शन मार्कर अभिव्यक्ति के अवलोकन के लिए अनुमति देता है।

2. एकीकृत ट्रांसजेनिक लाइनों का अलगाव

1. F1 जानवरों का चयन:
   1. अलग संस्कृति प्लेटों पर एकल 150-200 फ्लोरोसेंट F1 जानवरों। अत्यधिक संचारण लाइनों (≥80%) के लिए, 100 F1 जानवर पर्याप्त हैं।
   2. इन F1 प्लेटों को 15-25 डिग्री सेल्सियस पर रखें जब तक कि संतान फ्लोरोसेंट F2 जानवरों के अवलोकन के लिए उपयुक्त चरण तक न पहुंच जाए।
   3. सभी F1 प्लेटों या तो मैं प्रदर्शन) कोई संतान, यह दर्शाता है कि F1 जानवर बाँझ था या मर गया, या ii) नहीं या केवल कुछ फ्लोरोसेंट F2 जानवरों, यह दर्शाता है कि F1 जानवर अपेक्षित दर पर ट्रांसजीन संचारित नहीं किया । यह कदम त्वरित है और मानक प्रोटोकॉल की तुलना में एक वास्तविक लाभ का प्रतिनिधित्व करता है जिसके लिए ≥75% फ्लोरोसेंट संतान(तालिका 1)का प्रदर्शन करने वाले F1 प्लेटों का चयन करने के लिए फ्लोरोसेंट F2 कीड़े के प्रतिशत का अनुमान लगाना आवश्यक है।
2. F2 जानवरों का चयन:
   1. प्रत्येक चयनित F1 प्लेट से एकल चार फ्लोरोसेंट ट्रांसजेनिक F2 जानवर। फ्लोरोसेंट ट्रांसजीन (उदाहरण के लिए एमसीएचरी, जीएफपी या डीएसरेड) का उपयोग करते समय, उच्च स्तर के फ्लोरेसेंस के साथ एफ 2 कीड़े चुनें क्योंकि इससे यह संकेत मिल सकता है कि ये जानवर एकीकृत सरणी के लिए होमोज़िगस हैं। ध्यान दें कि F2 जानवरों को उठाते समय अगले चरण में झूठे नकारात्मक से बचने के लिए अंडे या लार्वा के साथ नहीं ले जाना महत्वपूर्ण है।
   2. 15-25 डिग्री सेल्सियस पर F2 जानवरों को विकसित करें।
3. एकीकृत ट्रांसजेनिक उपभेदों का अलगाव और सत्यापन:
   1. 100% फ्लोरोसेंट ट्रांसजेनिक एफ 3 कीड़े के लिए स्क्रीन F2 प्लेटें। स्क्रीन काफी तेजी से है क्योंकि एक ही गैर-गैर-फ्लोरोसेंट कीड़े की उपस्थिति इंगित करती है कि प्लेट को फेंक दिया जाना चाहिए। एकीकृत ट्रांसजीन के लिए एक F2 पशु समरूप 100% होमोज़िगस फ्लोरोसेंट संतान देगा।
   2. ट्रांसजीन की 100% विरासत की पुष्टि करने के लिए चयनित प्लेटों से एकल आठ फ्लोरोसेंट F3 जानवर। सिद्धांत रूप में, एक जानवर उठा इस कदम पर पर्याप्त है । हालांकि, आठ फ्लोरोसेंट F3 जानवरों को चुनने के लिए अतृप्त या अस्वस्थ जानवरों का चयन करने से बचने के लिए आवश्यक हो सकता है क्योंकि विकिरण बेतरतीब ढंग से उत्परिवर्तन को प्रेरित कर सकता है जो कृमि शरीर विज्ञान के लिए महत्वपूर्ण जीन को प्रभावित करते हैं।
   3. यदि संभव हो तो कई स्वतंत्र एकीकृत ट्रांसजेनिक उपभेदों, यानी विभिन्न F1 जानवरों से बरामद उपभेदों रखो।

Representative Results

तालिका 1. सी एलिगेंसजीनोम में एक्सट्राक्रोमोमोमल सरणी एकीकरण के लिए मानक और बेहतर प्रोटोकॉल कीतुलना। मानक या बेहतर प्रोटोकॉल का उपयोग करके लगभग एक ही आवृत्ति पर प्रसारित होने वाले दो नॉनइंटेग्रेटेड ट्रांसजीन को एकीकृत किया गया था। मुख्य अंतर इस तथ्य में निहित है कि मानक प्रोटोकॉल में सभी F1 प्लेटों पर संतान की स्क्रीन ट्रांसजेनिक F2 कीड़े के प्रतिशत का अनुमान लगाने के लिए की जाती है, जिसे 75% ≥ जाना चाहिए। यह कदम एक लंबा समय लेता है, खासकर अगर संचरण की प्रारंभिक दर ७५% के करीब है । बेहतर प्रोटोकॉल में, ट्रांसजेनिक एफ 2 जानवरों को ले जाने वाली प्रत्येक F1 प्लेट से एकल चार एफ 2 कीड़े के लिए पर्याप्त है और संतान (F3) में ट्रांसजेनिक कीड़े के 100% के लिए स्क्रीन करने के लिए पर्याप्त है, जिसे जल्दी से किया जा सकता है। मानक प्रोटोकॉल अनुकूलित किया जाता है।  

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
U.V. cross-linker	Fischer Scientific		Wavelength 254 nm
Microscope SteREO Discovery V8	Carl Zeiss, Inc.
Petri dishes, 60 mm	CML	BPS55E6
Platinium wire 0.25 mm	Alfa Aesar	6/4/7440	To make a pick for worms