УФ-облучение: метод интеграции экстрахромосомных массивов

Overview

Микроинъекция трансгенов обычно приводит к штаммам C. elegans с большими экстрахромосомными массивами, что приводит к переменной экспрессии и передаче трансгена.  УФ-облучение может вызвать хромосомную интеграцию массива и более стабильную трансгенную передачу.

Protocol

Этот протокол является выдержкой из Мариол и др., Быстрый протокол для интеграции экстрахромосомных массивов с высокой скоростью передачи в геном C. elegans , J. Vis. Exp. (2013).

1. УФ-облучение и восстановление трансгенных червей

1. Облучение червя:
   1. Выберите 30-100 флуоресцентных трансгенных L4 животных на отдельные пластины культуры (15-20 животных по тарелке).
   2. Поместите пластины, с крышками удалены, в УФ-кросс-линкер. Облучение червей на 0,012 J/cm². Обратите внимание, что штаммы более или менее чувствительны к УФ и что результаты могут быть переменными в зависимости от используемого УФ-облучения. Доза диапазоне между 0.010-0.015 J/cm² могут быть проверены.
2. Восстановление червя после облучения:
   1. Поместите пластины с облученными червями на ночь при 15 градусов по Цельсию для восстановления.
   2. Проверьте количество животных, которые живы. В наших руках выживаемость составляет около 80-90% приспособлена для эффективного облучения.
   3. Выращивать облученных животных при 15-25 градусов по Цельсию до тех пор, пока потомство не достигло стадии развития, позволяющей засовытить выражение маркера монеты.

2. Изоляция интегрированных трансгенных линий

1. Выбор животных Формулы-1:
   1. Одноместные 150-200 флуоресцентных F1 животных на отдельные пластины культуры. Для высокоперемеющих линий (≥80%) достаточно 100 животных F1.
   2. Держите эти пластины F1 на 15-25 градусов по Цельсию, пока потомство не достигнет соответствующей стадии для наблюдения флуоресцентных животных F2.
   3. Отбросьте все пластины F1, выставляют либо i) никакого потомства, указывая, что животное F1 было стерильным или умерло, или ii) нет или только несколько флуоресцентных животных F2, указывая, что животное F1 не передавал трансген с ожидаемой скоростью. Этот шаг является быстрым и представляет собой реальное преимущество по сравнению со стандартным протоколом, который требует оценки процента флуоресцентных червей F2 для того, чтобы выбрать пластины F1 выставке ≥75% флуоресцентного потомства (Таблица 1).
2. Выбор животных F2:
   1. Одноместные четыре флуоресцентных трансгенных F2 животных из каждой выбранной пластины F1. При использовании флуоресцентных трансгенов (например, mCherry, gfp или dsRed) выберите червей F2 с высоким уровнем флуоресценции, так как это может свидетельствовать о том, что эти животные однородны для интегрированного массива. Обратите внимание, что при сборе F2 животных очень важно не носить с собой яйца или личинки, чтобы избежать ложных негативов на следующем шаге.
   2. Выращиваем животных F2 при 15-25 градусах Цельсия.
3. Изоляция и проверка интегрированных трансгенных штаммов:
   1. Экран F2 пластин для 100% флуоресцентных трансгенных червей F3. Экран довольно быстрый, так как наличие одного нефторесцентного червя указывает на то, что пластина должна быть выброшена. F2 животных однородных для интегрированного трансгена даст 100% однородных флуоресцентных потомства.
   2. Одиночные 8 флуоресцентных животных F3 от выбранных плит для того чтобы подтвердить 100% наследование transgene. Теоретически, выбора одного животного достаточно на этом этапе. Тем не менее, сбор восьми флуоресцентных F3 животных может быть необходимо, чтобы избежать выбора неутверенных или нездоровых животных, как облучение может случайно вызвать мутации, которые влияют на гены, важные для физиологии червя.
   3. По возможности держите несколько независимых интегрированных трансгенных штаммов, т.е. штаммов, восстановленных у различных животных F1.

Representative Results

Таблица 1. Сравнение стандартных и усовершенствованных протоколов для экстрахромосомных массивов интеграции вгеном C. elegans. Два неинтегрированных трансгена, передающих примерно на одной частоте, были интегрированы с использованием стандарта или улучшенного протокола. Основное отличие заключается в том, что в стандартном протоколе выполняется экран потомства на всех пластинах F1 для оценки доли трансгенных червей F2, который должен быть ≥ 75%. Этот шаг занимает много времени, особенно если начальная скорость передачи близка к 75%. В улучшенном протоколе достаточно выделить четырех червей F2 с каждой пластины F1, несущих трансгенных животных F2, и провести проверку на 100% трансгенных червей в потомении (F3), которые могут быть выполнены быстро. Стандартный протокол адаптирован.  

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
U.V. cross-linker	Fischer Scientific		Wavelength 254 nm
Microscope SteREO Discovery V8	Carl Zeiss, Inc.
Petri dishes, 60 mm	CML	BPS55E6
Platinium wire 0.25 mm	Alfa Aesar	6/4/7440	To make a pick for worms