Overview
Mikroinjektion av transgener resulterar vanligtvis i C. elegans stammar med stora extrachromosomal arrays, vilket resulterar i varierande uttryck och överföring av transgen. UV-bestrålning kan inducera kromosomintegration av matrisen och stabilare transgeneöverföring.
Protocol
Detta protokoll är ett utdrag från Mariol et al, A Rapid Protocol for Integrateing Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate into the C. elegans Genome, J. Vis. Exp. (2013).
1. UV-bestrålning och återhämtning av transgena maskar
- Mask bestrålning:
- Välj 30-100 fluorescerande transgena L4-djur på separata odlingsplattor (15-20 djur per tallrik).
- Placera plattorna, med locken borttagna, i en UV-korslänkare. Bestråla maskarna på 0.012 J/cm2. Observera att stammar är mer eller mindre känsliga för UV och att resultaten kan variera beroende på vilken UV-bestrålare som används. Ett dosområde mellan 0,010-0,015 J/cm2 kan testas.
- Återhämtning av maskar efter bestrålning:
- Placera plattor med bestrålade maskar över natten vid 15 °C för återhämtning.
- Kontrollera om det finns djur som lever. I våra händer är en överlevnadsgrad på cirka 80-90% anpassad för en effektiv bestrålning.
- Odla de bestrålade djuren vid 15-25 °C tills avkomman har nått utvecklingsstadiet vilket möjliggör observation av myntmarkeringsuttrycket.
2. Isolering av integrerade transgena linjer
- Urval av F1-djur:
- Enstaka 150-200 fluorescerande F1-djur på separata odlingsplattor. För mycket överförande linjer (≥80%), 100 F1 djur räcker.
- Förvara dessa F1-plattor vid 15-25 °C tills avkomman når ett lämpligt stadium för observation av fluorescerande F2-djur.
- Kassera alla F1-plattor som uppvisar antingen i) ingen avkomma, vilket indikerar att F1-djuret var sterilt eller dött, eller ii) inga eller endast få fluorescerande F2-djur, vilket indikerar att F1-djuret inte överför transgenet i förväntad takt. Detta steg är snabbt och representerar en verklig fördel jämfört med standardprotokollet som kräver en uppskattning av andelen fluorescerande F2-maskar för att välja F1-plattor som uppvisar ≥75% fluorescerande avkomma (tabell 1).
- Urval av F2-djur:
- Enstaka fyra fluorescerande transgena F2-djur från varje vald F1-platta. När du använder fluorescerande transgener (till exempel mCherry, gfp eller dsRed), välj F2-maskar med hög fluorescens eftersom detta kan indikera att dessa djur är homozygous för den integrerade matrisen. Observera att när man plockar F2-djur är det viktigt att inte bära med ägg eller larver, för att undvika falska negativ i nästa steg.
- Odla F2 djur vid 15-25 °C.
- Isolering och validering av integrerade transgena stammar:
- Skärm F2-plattor för 100% fluorescerande transgena F3-maskar. Skärmen är ganska snabb eftersom närvaron av en enda icke-fluorescerande mask indikerar att plattan ska kastas bort. En F2 djur homozygous för den integrerade transgenen kommer att ge 100% homozygous fluorescerande avkomma.
- Enstaka åtta fluorescerande F3-djur från utvalda plattor för att bekräfta 100% arv av transgenen. I teorin räcker det att välja ett djur i detta steg. Att välja åtta fluorescerande F3-djur kan dock vara nödvändigt för att undvika att välja ofruktbara eller ohälsosamma djur eftersom bestrålning slumpmässigt kan inducera mutationer som påverkar gener som är viktiga för maskfysiologi.
- Om möjligt behålla flera oberoende integrerade transgena stammar, dvs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tabell 1. Jämförelse av standard och förbättrade protokoll för extrachromosomal arrays integration i C. elegans genomet. Två ickeintegrerade transgener som sänder med ungefär samma frekvens integrerades med hjälp av standarden eller det förbättrade protokollet. Den största skillnaden ligger i det faktum att i standardprotokollet utförs en skärm av avkomman på alla F1-plattor för att uppskatta andelen transgena F2-maskar, som bör ≥ 75%. Detta steg tar lång tid, särskilt om den ursprungliga överföringshastigheten är nära 75%. I det förbättrade protokollet är det tillräckligt att singel fyra F2-maskar från varje F1-platta som bär transgena F2-djur och att screena för 100% av transgena maskar i avkomman (F3), som kan utföras snabbt. Standardprotokollet är anpassat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
U.V. cross-linker | Fischer Scientific | Wavelength 254 nm | |
Microscope SteREO Discovery V8 | Carl Zeiss, Inc. | ||
Petri dishes, 60 mm | CML | BPS55E6 | |
Platinium wire 0.25 mm | Alfa Aesar | 6/4/7440 | To make a pick for worms |