Summary
基因的功能，可以掩盖损失功能的实验中，如果有另一种基因的赔偿。斑马鱼模型提供了一个相对高通量的手段来揭示生活胚胎这样的功能冗余。
Abstract
通常由胚胎发育过程中基因功能丧失功能的实验，例如，通过有针对性的突变在小鼠（淘汰赛）。在斑马鱼模型，有效的反向遗传技术已经开发使用微量注射特定基因的反义morpholinos。 Morpholinos目标，通过特定的碱基配对和阻止基因的功能mRNA的瞬时抑制翻译或数天的胚胎发育过程中的拼接（击倒）。然而，在脊椎动物，如鼠标或斑马鱼，一些基因的功能可以被遮蔽的损失进行补偿的另一种基因的存在，由于这些方法。这是基因姐姐在同一发展组织共同表达的基因的家庭尤其如此。在斑马鱼，补偿功能，可以在一个相对高通量的方式进行测试，共注射morpholinos目标击倒的这两个基因同时。同样，使用morpholinos，任何两个基因之间的遗传相互作用，可以证明这两个基因敲除在亚阈值水平。例如，morpholinos可滴定等，无论是个人击倒生成一个表型。下，如果这些条件中，双方morpholinos的合作注入导致的表型，是一种遗传性的互动。在这里，我们演示了如何显示在两个相关的转录因子GATA转录因子方面的功能冗余。转录因子GATA因素是必不可少的心脏祖细胞的规范，但是这仅仅是损失Gata5和Gata6透露。我们如何进行显微注射实验，验证morpholinos，评估补偿cardiogenesis表型。
Protocol
我们的目标是测试规范心肌祖细胞的两个转录因子的功能冗余。由两个gata5和gata6相关基因编码的因素和我们使用的是斑马鱼的模型，以了解他们的相关功能。我们的战略是阻止基因的功能，使用morpholinos 2 。我们将一个或成受精卵基因注入morpholinos，并与来自鸡蛋注射morpholinos同时的胚胎胚胎的表型。为了简化表型的评价，我们使用携带基因对心肌细胞的GFP从鱼的卵。
第1步。准备用于显微注射。
a）建立养殖对鱼
晚上，在注射之前，单身男性和单身女性成鱼（3-18个月的年龄）被放置在对分频器隔开，直到第二天早上饲养员坦克。我们通常会成立10-20对鱼，这些都是每周一次交配，无论鸡蛋是否将使用，维护繁殖力。在这个实验中，我们使用了记者的应变，cmlc2转基因：EGFP，因为它提供了一个简单的读数，找出与众不同的心肌。第二天早晨，当灯都打开，水是改变，而分频器允许鱼对交配和产生卵子坦克的拉。蛋产量可监控，并可能立即启动，或经过一个小时或更长时间内，根据鱼。通常情况下，不间断的交配后约20分钟，鸡蛋是用吸管或过滤器收集到100毫米的Petri系统水菜浇。重要的是要监察鸡蛋的生产，以保证之间的1-4细胞阶段的胚胎注入。一次释放几双，这是可以错开产蛋量，从而最大限度地提高鸡蛋的数量可以在早期发育阶段的注射。一双好鱼可能会产生超过200个胚胎，它使在同一时间收集数以千计的鸡蛋没有实际意义，因为一个单一的研究者将无法注入速度不够快，超出4细胞阶段发展之前，他们。鱼受到刺激滋生的光周期，所以这是一个实验，需要尽早开始，和鸡蛋中午过后通常不会获得。
二）准备针
- 使用微管牵引器和一个3.5“玻璃毛细管产生两针，使用下列条件：热= 626，拉= 60，速度= 60，时间= 250，我们用开放的核心不包含灯丝的针，因为。我们面前填写吸痰。
- 然后轻轻地打破每一针的尖端是用干净的刀片或镊子，并随后在30度角为20秒左右的斜角使用一个EG - 4微型磨床。这磨尖，重要的是，如果你通过绒毛膜注入。
- 重要的是要取得一致的针针尖大小直径约15微米（使用网格的显微镜目镜，能够校准1-2 NL注射量为4单位校准）。
- 针应提前做好准备，安全地存储在一个安全的位置，每个单独校准开始之前注射，以保证一致的注射量（详见D节）。如果你是幸运的，你可能能够为整个实验过程中使用的单针。然而，一针可以很容易地打破在一个实验中，你不想使用时间拉新针。
c）在注射板
- 准备100毫升2％琼脂糖系统水的解决方案，在微波炉中煮沸。
- 凉爽的触感，倒到一个100mm的培养皿倒盖12毫升。
- 插入2显微镜幻灯片，在大约45度角倾斜，到双方的盖子。一旦琼脂糖已经凝固，轻轻一拉两个幻灯片远离盖子。
- 这将创建胚胎将被放置，并随后注入的低谷。多个板块可以提前准备的时间。它们可以无限期地储存在4 ° C加入了一层70％的乙醇后，加入原板的底部，并用封口膜密封。请记住，使用前清洗。
D）的显微注射站和针校准
- 打开压缩氮气源的PLI - 100微量。喷油器应调整为一个恒定的流量压力18 PSI。
- 在插入一根针，保证的显微操纵器是在一个适当的位置，让广泛的运动，并插入针不会罢工表。插入一个针头准备（见C部分）为确保有一个密封的显微。不小心打破针。
- 观察针尖在显微镜下，以确保它不是堵塞，然后再进行校准。
- 广场上的封口膜的小片，注射液DDH 2 O的一个下降（2-3μL）和填充使用填充按钮拉进针约1.5 μL。确保您已完全解决方案中的针尖，并通过显微镜观察液体吸，以避免任何气泡绘图。
- 将下降到微米电网的矿物油。
- 凭经验调整注射的时间，以确保墨滴大小，直径约为1.5微米。这将提供一个〜1.8 NL的注射量。实际体积可以调整到您所选择的，但在实际意义上说，它是很难准确校准低于1 NL卷，胚胎可能不会容忍上述2 NL卷。无论音量大小，您选择，保持它包括控制您的所有注射相同，并调整您的解决方案（而不是注射量）浓度滴定的注射啉量。
- 重新校准是必要的时间，因为每次更换针针尖大小会有所不同。
第2步。针对两个不同的基因morpholinos的验证
Morpholinos设计为目标的翻译起始位点或目标从而阻止蛋白质的合成或适当的mRNA加工的基因的剪接位点。当首次基因分析中，我们使用morpholinos这两种类型的测试，如果它们产生相同的表型，说明具体击倒。剪接受体阻滞剂的一个好处是，你可以验证通过RT - PCR，如果不可用的靶基因的抗体，这是特别有用的正常谈话内容击倒。我们将说明gata5和gata6使用morpholinos（gata5 5'UTR莫序列的基因，如何取得一致的心脏表型是：5' - AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT - 3'; gata5剪接位点MO序列：5' - TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA - 3 '; gata6 5 'UTR区莫序列：5' - AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA - 3'）。
- 基因工具，LLC（Philomath，或）获得Morpholinos。基因工具将帮助您选择最佳的目标序列，如果你问他们的支持人员。你只需要向他们发送的加入，他们将建议。然而，没有保证，吗啉工作，这就是为什么你需要做好准备，以验证活动。您也可以检查吗啉是从OpenBiosystems。基因工具提供合成morpholinos股票OpenBiosystems。虽然又是不能保证它会工作，他们以较低的成本出售数量较少，这可能有助于支付费用，用于测试新的目标。一定要爆你吗啉对转录;我们使用的UCSC的斑马鱼的基因组浏览器（genome.ucsc.edu）BLAT功能。当然，如果啉已验证文献中（严格），建议您购买相同的序列。
- 吗啉是溶解在无菌DDH 2 0到终浓度为1毫米，并在室温下储存。不要冻结啉的解决方案，低温条件下，由于某种原因有时会导致他们聚集和沉淀。 Morpholinos蛋白酶或核酸不敏感，所以只要您添加的水是无菌的，他们应在室温下非常安全的。
- 注射前，孵化啉在65℃，5分钟，以确保它完全溶解，并允许冷却到室温。不要放在冰样本。保持在室温，直到注射吗啉。
- 滴定一个吗啉，我们通常准备连续稀释的股权集中在2 0 DDH，产量为1毫米的工作浓度，0.5毫米，0.25毫米和0.125毫米。根据序列，使用的注射量1.8 NL，这代表约20ng，10ng，5ng，每次注射啉2.5ng。这仅仅是一个起点，因为每个啉的宽容和疗效会有所不同，并不能预测。大多数morpholinos不会被容忍，远高于20纳克，但有些可以有效剂量远低于1纳克。我们的做法是定义的集中表现型“高原”。换句话说，如果定义的表型没有看到使用2.5毫微克，但类似的使用任何金额达到或超过5纳克，我们会选择一个门槛金额为5毫微克。当然，它可能是有用的，以2.5 ng和5.0纳克之间的未来滴定，以确保您已超过阈值的重复性工作，而不是权利“边界”。
- 填写连接和校准针（见上文）的最低工作浓度（最稀）吗啉的解决方案。避免过度充盈针，因为它只会浪费材料。如果您填写只有1μL，有500注射足够的解决方案。
- 使用一次性吸管，转让受精卵细胞胚胎显微注射板槽。删除多余的水分，以确保胚胎秋天注射槽的底部。他们不应该浮动，而是坚持琼脂糖床。
- 注射板的位置，使显微可以通过蛋壳和蛋黄到注射针尖下降。要定位单个胚胎，操纵注射板等，注射针的尖端推或拉胚到正确位置。要小心，不要打破针尖或损坏胚胎！这需要一些练习，但是，作为一项规则，您使用简单的显微注射针头移动到胚胎，然后注射后，相当快速，干净，。移动板用另一只手（左手，如果你用你的右手注入）的胚胎被带进注射的位置。对于一个新的学习，它是有益的实践中使用含有0.25％酚红的一个解决方案，以可视化注入的解决方案。信心也获得通过注射的解决方案，含有荧光标记的微球（Molecular Probes公司的F - 8794），以确认解决方案是注入胚胎绒毛膜间的空间，而不是。然而，实践了几个回合后，这些艾滋病通常不再需要。这是一个好主意，偶尔注入空气，只是为了确认，针头不堵塞，被注入的量适当。
- 注射的胚胎调回一个100mm的Petri系统水盘，在28.5C培养。注射浓度最低的工作后，可以驱逐任何剩余的解决方案和未来最高工作吗啉的浓度用于填补针。重复每个啉的浓度。虽然它是针使用水冲洗，测试鲜明啉时，我们更愿意改变针头和校准。一定要保持一个队列uninjected胚胎，以验证特定批次的胚胎是否健康和正常的。
第3步。在个别的阈值剂量注射morpholinos
进行上述滴定的目标是为每个啉定义的阈值剂量。在最好的情况下，基本上100％的morphants会显示一个定义的表型，如果目标基因的基本功能。但是，可以预期一些变异因误注入工件。随着实践中，这不应该超过10％。胚胎（包括uninjected控制）的部分批次可能无法生存，在这种情况下的实验，可能需要要打折扣。同时，也有生物变异，因为个人的胚胎可能或多或少宽容的击倒。最后，一些morpholinos可能只是没有足够的效率，实现了强大的（渗透）击倒。如果表型产生的胚胎的比例很低，但重复性，它可能是值得测试鲜明啉。本实验的目标是，以确定是否被视为一个全新的表型时，这两个基因同时有针对性。我们不能简单地寻找有morphant表型的胚胎比例增加，但产生一个独特的表型，是不是达到或超过阈值水平，而在测试时的单个基因。
- 准备测试以前，在每一个人啉产生了定义的表型的阈浓度morpholinos组合的混合物。例如，如果每个基因的门槛为5毫微克，准备工作解决方案将包含5纳克每5纳克（10 ng总）。由于胚胎可能不会容忍远远超过20纳克的总吗啉，它是重要的，根据以前的实验中，使用少量每个足以有效地针对每一个基因。
- 控制应包括与每个啉单组合在相同浓度，注入胚胎套。注射液体积应保持不变（如1.8 NL）。记者应变的一个最大的好处是，你可以随时评估表型（如心肌细胞分化），并多次。如果胚胎阶段匹配的胚胎和控制进行评估原位杂交基因表达，可以固定在注射后不同时间。我们的实验中，我们将GFP的表达，在约24 HPF，评估作为心肌细胞分化的替代品。
第4步。 Ë估价表型
- 应监测注射的胚胎，注射后，多次在白天，以消除任何死亡或濒临死亡的胚胎，因为这些可以妥协的，其余morphants的的可行性。为了评估报告基因的表达，胚胎研究使用解剖显微镜配备有荧光的能力。我们使用尼康SMZ1500显微镜下，用1倍或1.6倍的目标和0.75倍的放大倍率范围从11.25x。用荧光过滤器时，务必打开隔膜完全开放的环境，以发挥最大的光强度。另外，一定要使用正确的过滤器，根据记者基因（GFP，RFP等）。
- 胚胎通常镇静剂tricaine磺酸4mg/ml股票的水系统使用一个1 / 20稀释。存储在- 20C冻结的股票。另外，胚胎可以安乐死使用的20倍tricaine股票。即使他们仍然在绒毛膜，胚胎通常可以筛选。然而，尤其是当它们将被拍到，这是一个好主意，用锋利的钳取出chorions。胚胎可以被看作后放置在抑郁症的幻灯片，在tricaine解决方案，或能更好地固定摆成一个小降3％甲基纤维素的摄影。
- 观察在注射morpholinos组合相比，单morphants胚胎的表型。在这里，我们正在寻找GFP表达原始心管的格局。在记者株GFP的表达通过cmlc2的推动者，这使得心脏的规范和心管形态发生的详细分析的心肌细胞。
代表性的成果
在我们的实验中，gata5和gata6单morphants显示重复性的心脏表型注射时的阈值水平，虽然有相当大的生物变异 3,4 。例如，大部分gata5 morphants产生裂心，在两个区域位于GFP的表达。出现这种情况，因为心脏祖细胞无法正确迁移保险丝在中线形成心管。然而，一些gata5 morphants产生有缺陷的心管，在少数（5％）有一个GFP +细胞的数量显着减少。我们认为，这反映了生物的变异，但也可能是由于这样的事实，不等同于“空”的突变morpholinos的。
同样，gata6 morphants所有显示心脏表型，但有一系列的表型，包括少数的双歧加热，和不安的心，是形态相比uninjected控制胚胎。这是不寻常的心脏形态表型变异，因为心脏形成是一个动态的过程，至少心脏表型的一些可能是由于从胚胎形成的缺陷间接的。然而，重要的是，gata5和gata6 morphants心脏形态缺陷的范围是一致的和可重复性，以及大部分的胚胎产生大量的GFP +心肌。
在形成了鲜明的对比gata5和gata6单morphants，这两个因素枯竭的胚胎完全丧失了GFP的表达，与心肌细胞丧失一致。因此，gata5和gata6每个人心脏的形态发生非冗余的功能，但是这两个基因在功能上是有区别的心肌细胞的生成要求的冗余。我们先前的研究表明了最早的心肌标志物，包括nkx2.5损失，提示心肌规范3要求。
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Discussion
在这里描述的实验，我们结合两个morpholinos，每个单独产生不同表型的范围，并发现一个完全不同的表型时，他们一起合作注入。当然，我们需要摆在首位，做实验的理由。我们怀疑这两个基因可能为早期功能补偿对方在这种情况下心脏规范，。这是因为基因高度相关（相同的DNA序列结合的能力）和重叠在胚胎发育 5的模式表示。此外，在果蝇遗传实验表明，GATA转录因子应为心脏规范6要求。
不过，也有其他情况下，这种策略可能会使用测试功能冗余或更普遍的遗传相互作用。首先，一个或两个基因敲除可能不会产生任何明显的表型。在这种情况下，是没有定义的阈值水平为每一个基因，并使用啉金额将定义的经验，以及他们如何通过胚胎的耐受性有限。同样，测试赔偿的理由很可能会是高度相关的基因，并确认共同表达模式。二，遗传相互作用，可以测试使用任何基因对亚阈值数量的morpholinos。在这一战略中，不产生表型的最大金额是用于每个啉。如果结合morpholinos生成一个表型，这提供了一个遗传相互作用的强有力的证据，尽管它可能是相当间接的，甚至代表并行的途径。第三，第二啉的合作注入可能抢救第一的表型，如果这两个基因在一个对抗性的方式（这又可能是间接的的）互动。虽然没有定义的限制，可以有针对性多少种不同的基因，在实际意义上的，它可能是3-4个基因，根据每啉是需要的阈值响应。
虽然这一般采用反向遗传学，以揭示新基因的功能的方法是比较高的吞吐量，也有考虑有关morpholinos的告诫。在结合morpholinos之前，需要相当大的努力来验证个人试剂，如果这不是已经完成。任何单一啉可能无法正常工作，而另一些可以产生针对“神器”，特别是广泛的凋亡激活相关的表型。试剂不便宜，如果两个或两个以上的morpholinos需要验证每个基因，这种投资可以显着。
可引导的几点思考实验的策略。
i）是有一个已知的突变表型？如果是这样，一个单一的表复制啉应该足够了。
二）是否有抗体可用吗？如果是这样，翻译-受体阻滞剂可能是首选，如果没有，这将是重要文件，剪接受体阻滞剂有效目标的前体mRNA。
三）你能拯救的mRNA注射morphant？如果一切正常，它提供了出色的证据吗啉特异性。然而，它往往可能无法正常工作，由于注射mRNA的不当定位。救援也可能被使用转座子为基础的转基因测试，因为这可能使紧缩的空间和时间比目标基因的表达控制。在这两种情况下，重要的是要确保救援基因是不针对啉。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
在编制本介绍我们感谢他们的帮助埃文斯实验室成员。原来，这里使用的morpholinos博士奥黛丽Holtzinger表示验证。 TE是由来自美国国立卫生研究院（HL064282 HL056182）的赠款支持。按照研究所动物护理和使用委员会规定的准则和法规威尔康乃尔医学院，进行动物实验。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fish breeder tanks and dividers | Aquatic Habitats | ||
| Fish nets | Aquatic Habitats | ||
| System water | 60mg Instant Ocean” per liter dH2O | ||
| 100mm Petri dishes | BD Biosciences | 351029 | |
| Micropipette needle puller | Sutter Instrument Co. | P-97 Flaming/Brown | |
| 3.5" glass capillaries | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| Razor blade | Personna Medical Care | 94-120-71 | |
| Micro grinder | Narishige International | EG-4 | |
| Gridded microscope eyepiece | Premiere | MF-02 | |
| Micrometer | WARD’s Natural Science | 94 W 9910 | |
| Ultrapure agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| Spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| Scale | Mettler Toledo | AB54-S/FACT | |
| Disposable weigh dishes | Fisher Scientific | 2-202-B | |
| Conventional microwave | GE Healthcare | ||
| Erlenmeyer flask | Corning | 4980 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-552 | |
| Graduated cylinder | Fisher Scientific | 08-572-6D | |
| Automatic pipette man | BrandTech | 2026333 | |
| 70% ethanol wash solution | Tarr | 801VWR | |
| N2 tank | Tech Air | ||
| Microinjector | Harvard Apparatus | PLI-100 | |
| Micromanipulator | Micro Instruments | LTD | |
| Dissecting microscope | Nikon Instruments | SMZ1500 | |
| Parafilm | American National Can | PM-992 | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5904 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Corporation | 34155 | |
| gata5 splice site morpholino | Genetools, LLC | 5’-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3’ | |
| gata5 ATG Blocker | Genetools, LLC | 5’-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3’ | |
| gata6 Long Isoform ATG Blocker | Genetools, LLC | 5’-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3’ | |
| Disposable Pasteur Pipette | Fisher Scientific | 13-678-20B | |
| Tricaine Methanesulfonate | Argent Labs | MS-222 | |
| Methycellulose | ICN Biomedicals | 155495 | |
| Heat Block | Fisher Scientific | 11-718-4 | |
| Sharp forceps | Dumont | Size 55 | |
| Depression Microslides | VWR international | 48339-009 |
References
- Heicklen-Klein, A., McReynolds, L. J., Evans, T. Using the zebrafish model to study GATA transcription factors. Semin Cell Dev Biol. 16, 95-106 (2005).
- Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6, 69-77 (2009).
- Holtzinger, A., Evans, T. Gata5 and Gata6 are functionally redundant in zebrafish for specification of cardiomyocytes. Dev Biol. 312, 613-622 (2007).
- Peterkin, T., Gibson, A., Patient, R. Redundancy and evolution of GATA factor requirements in development of the myocardium. Dev Biol. 311, 623-635 (2007).
- Holtzinger, A., Evans, T. Gata4 regulates the formation of multiple organs. Development. 132, 4005-4014 (2005).
- Sorrentino, R. P., Gajewski, K. M., Schulz, R. A. GATA factors in Drosophila heart and blood cell development. Semin Cell Dev Biol. 16, 107-116 (2005).
