Une approche de génétique inverse pour tester redondance fonctionnelle pendant l'embryogenèse

Summary

La fonction des gènes peut être obscurci dans la perte de fonction des expériences s'il ya compensation par un autre gène. Le modèle de poisson zèbre offre un relativement haut-débit moyen de révéler de telles redondance fonctionnelle dans les embryons vivants.

Abstract

La fonction des gènes durant l'embryogenèse est généralement définie par une perte de fonction des expériences, par exemple par mutagenèse ciblée (KO) chez la souris. Dans le modèle de poisson zèbre, efficaces techniques de génétique inverse ont été développées en utilisant la micro-injection d'morpholinos antisens spécifiques du gène. Morpholinos cibler un ARNm grâce à l'appariement de bases spécifiques et la fonction des gènes bloquer transitoirement par la traduction ou de l'inhibition de l'épissage pendant plusieurs jours lors de l'embryogenèse (à plat). Cependant, chez les vertébrés tels que souris ou le poisson-zèbre, certaines fonctions des gènes peut être obscurcie par ces approches en raison de la présence d'un autre gène qui compense la perte. Cela est particulièrement vrai pour les familles de gènes contenant des gènes soeur qui sont co-exprimés dans les mêmes tissus en développement. Dans le poisson-zèbre, une compensation fonctionnelle peut être testée de manière relativement haut-débit, par co-injection de morpholinos que knockdown cible des deux gènes simultanément. De même, en utilisant morpholinos, une interaction génétique entre deux gènes peut être démontrée par knockdown des deux gènes ensemble à des sous-niveaux de seuil. Par exemple, morpholinos peut être titrée de telle sorte que ni le knockdown individuelles génère un phénotype. Si, dans ces conditions, la co-injection des deux morpholinos provoque un phénotype, une interaction génétique est indiquée. Ici nous démontrons comment montrer la redondance fonctionnelle dans le contexte de deux facteurs de transcription GATA liées. Facteurs GATA sont essentiels pour la spécification des progéniteurs cardiaques, mais ce n'est révélée que par la perte des deux Gata5 et Gata6. Nous montrons comment réaliser des expériences de micro-injection, de valider les morpholinos, et évaluer le phénotype compensé cardiogenèse.

Protocol

Notre but ici est de tester la redondance fonctionnelle des deux facteurs de transcription pour la spécification des progéniteurs des cardiomyocytes. Les facteurs sont codés par deux gènes liés gata5 et gata6 et nous utilisons le modèle de poisson zèbre pour comprendre leurs fonctions relatives ^1. Notre stratégie est de bloquer la fonction des gènes en utilisant morpholinos ^2. Nous allons injecter morpholinos pour l'une ou l'autre gène dans des œufs fécondés, et comparer le phénotype embryonnaire avec des embryons dérivés d'œufs injectés simultanément avec les deux morpholinos. Pour simplifier l'évaluation des phénotypes, nous utilisons des œufs provenant de poissons qui portent un transgène exprimant la GFP dans les cardiomyocytes.

Etape 1. Préparation pour la microinjection.

A) La mise en place de couples reproducteurs de poissons

La soirée avant l'injection, seule et unique poisson mâle adulte de sexe féminin (3-18 mois d'âge) sont placés par paires dans des réservoirs séparés par un éleveur diviseur jusqu'au lendemain matin. Nous généralement mis en place 10-20 paires de poissons, et ce sont accouplés une fois par semaine, indépendamment du fait que les œufs seront utilisés, afin de maintenir la fécondité. Pour cette expérience, nous sommes en utilisant une souche journaliste, transgéniques pour cmlc2: EGFP, car il fournit une lecture simple pour identifier les cardiomyocytes de différenciation. Le lendemain matin, une fois les lumières sont allumées, l'eau est changée, et les diviseurs sont tirés de réservoirs permettant de paires de poissons à s'accoupler et à produire des oeufs. La production d'œufs peuvent être surveillés, et peut entamer immédiatement, ou après une période d'une heure ou plus, selon les poissons. Généralement, après environ 20 minutes de l'accouplement ininterrompue, les œufs sont recueillis à l'aide d'une pipette ou un tamis et on verse dans 100 boîtes de Petri contenant de l'eau mm système. Il est important de surveiller la production d'œufs afin d'assurer que les embryons sont injectés entre les stade 1-4 cellules. En libérant plusieurs paires à la fois, il est possible d'échelonner la production d'oeufs et ainsi maximiser la quantité d'oeufs qui peuvent être injectées à un stade précoce de développement. Une bonne paire de poissons peuvent générer plus de 200 embryons, et il ne fait aucun sens pratique de recueillir des milliers d'oeufs dans le même temps, car un seul chercheur ne serait pas en mesure de les injecter assez rapidement avant qu'ils ne développent au-delà du stade de 4 cellules . Les poissons sont stimulés pour se reproduire sur le cycle de lumière, si ce n'est une expérience qui requiert un démarrage rapide, et les œufs ne sont pas habituellement obtenue après midi.

B) Préparation des aiguilles

1. Utilisez un extracteur Micropipette et un tube de verre 3,5 "capillaire afin de générer deux aiguilles en utilisant la condition suivante: chaleur = 626, Pull = 60, vitesse = 60, et de l'heure = 250 Nous utilisons des aiguilles coeur ouvert qui ne contiennent pas de filament, parce que. nous leur front-fill avec aspiration.
2. L'extrémité de chaque aiguille est ensuite délicatement cassés à l'aide d'une lame de rasoir propre ou forceps, et ensuite biseautés à un angle de 30 degrés pendant environ 20 secondes à l'aide d'une meuleuse micro-EG-4. Cette aiguise la pointe et qui est important si vous injecter à travers le chorion.
3. Il est important d'obtenir une taille d'aiguille cohérente diamètre de la pointe d'environ 15 microns (calibré que 4 unités à l'aide d'un oculaire de microscope quadrillées, d'être capable de calibrer un volume d'injection 1-2 nl).
4. Les aiguilles doivent être préparées à l'avance, sont rangés dans un endroit sûr, et chacun est individuellement calibré, juste avant de commencer les injections pour assurer le volume d'injection constante (voir la section D pour plus de détails). Si vous êtes chanceux, vous pourriez être en mesure d'utiliser une seule aiguille pour une expérience entière. Cependant, une aiguille peut facilement casser en plein milieu d'une expérience, et vous ne voulez pas utiliser ce temps pour tirer de nouvelles aiguilles.

C) la fabrication de plaques d'injection

1. Préparer 100 ml d'une solution à 2% d'agarose dans de l'eau du système, en faisant bouillir dans un four à micro-ondes.
2. Froid au toucher, et verser environ 12 ml dans le couvercle inversé d'un plat de Pétri de 100 mm.
3. Insérez deux lames de microscope, inclinée à environ 45 degrés, dans les deux côtés du couvercle. Une fois que l'agarose est solidifié, tirez doucement les deux diapositives loin du couvercle.
4. Cela crée des creux où les embryons seront placées et ensuite injecté. Plusieurs plaques peuvent être préparées à l'avance. Ils peuvent être conservés indéfiniment à 4 ° C après l'ajout d'une couche d'éthanol à 70%, en ajoutant au bas de la plaque d'origine, et l'étanchéité avec du parafilm. N'oubliez pas de laver bien avant utilisation.

Station de microinjection D) et l'étalonnage d'aiguille

1. Allumez la source d'azote comprimé et PLI-100 microinjecteur. L'injecteur doit être ajustée pour une pression de débit constant de 18 psi.
2. Avant d'insérer une aiguille, s'assurer que le micromanipulateur est dans une bonne position pour permettre à un large éventail de mouvement, et que d'une aiguille insérée sera pas frapper la table. Insérez l'un desles aiguilles préparée précédemment (voir section C) dans le micromanipulateur s'assurer qu'il ya un joint étanche. Attention à ne pas casser l'aiguille.
3. Observez la pointe de l'aiguille sous le microscope pour s'assurer qu'il n'est pas bouché avant de procéder à l'étalonnage.
4. Déposer une goutte (2-3 pi) de solution injectable ou ddH ₂ O sur un petit morceau de parafilm et remplir environ 1,5 pl en le tirant dans l'aiguille en utilisant le bouton de remplissage. Soyez sûr que vous avez la pointe de l'aiguille pleinement à la solution, et d'observer l'aspiration de liquide à travers le microscope afin d'éviter de dessin dans les bulles d'air.
5. Déposer une goutte d'huile minérale sur la grille d'un micromètre.
6. Ajustez empiriquement moment de l'injection pour s'assurer que la taille des gouttes est d'environ 1,5 micron de diamètre. Cela donnera un volume d'injection de ~ 1,8 nl. Le volume réel peut être ajusté à votre choix, mais dans un sens pratique il est difficile de calibrer précisément les volumes inférieurs à 1 nl, et les embryons peuvent ne pas tolérer des volumes supérieurs à 2 nl. Indépendamment de la taille du volume que vous choisissez, garder les mêmes pour tous vos injections, y compris les contrôles, et ajuster vos concentrations de solution (plutôt que le volume d'injection) pour titrer la quantité d'injection morpholino.
7. Recalibrage est nécessaire à chaque fois une aiguille est remplacée, depuis le bout de l'aiguille tailles varient.

Etape 2. Validation des morpholinos ciblant deux gènes distincts

Morpholinos sont conçus pour cibler le site d'initiation de traduction ou des sites d'épissage d'un ARNm cible, bloquant ainsi la synthèse des protéines ou de maturation de l'ARNm approprié. Lors de l'analyse d'un gène pour la première fois, nous utilisons deux types de morpholinos de tester si elles génèrent le même phénotype, indiquant un effet de choc spécifique. Un avantage de l'épissure-bloquant est que vous pouvez vérifier le knockdown de la transcription normale par RT-PCR, qui est particulièrement utile si des anticorps pour le gène cible ne sont pas disponibles. Nous allons illustrer comment un phénotype compatible cardiaque est atteint pour la gata5 et gata6 gènes en utilisant morpholinos (gata5 5'UTR MO séquence: 5'-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3 '; gata5 site d'épissage MO séquence: 5'-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3'; gata6 5 'UTR MO séquence: 5'-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3').

1. Morpholinos sont obtenus à partir de Gene Tools, LLC (Philomath, OU). Outils Gene vous aidera à choisir la meilleure séquence de la cible, si vous demandez à leur personnel de soutien. Vous avez seulement besoin de leur envoyer le numéro d'accession, et ils vont conseiller. Cependant, il n'existe aucune garantie que le morpholino va fonctionner, c'est pourquoi vous devez être prêt à valider l'activité. Vous pouvez également vérifier si le morpholino est disponible à partir OpenBiosystems. Outils Gene fournit des stocks de morpholinos synthétisés pour OpenBiosystems. Bien qu'il y ait encore une fois aucune garantie que cela fonctionnera, ils vendent de petites quantités à un coût inférieur, ce qui peut aider à défrayer les coûts pour les tests de nouvelles cibles. Soyez sûr de votre BLAST morpholino contre le transcriptome, nous utilisons la fonction BLAT sur le navigateur UCSC zebrafish génome (genome.ucsc.edu). Bien sûr, si un morpholino a été validé (rigoureusement) dans la littérature, il est recommandé que vous achetez cette même séquence.
2. Le morpholino est dissous dans l'stériles ddH ₂ 0 à une concentration finale de 1 mM et stockées à température ambiante. NE PAS congeler les solutions morpholino, pour quelque raison que les basses températures peuvent parfois leur causer d'agréger et de précipité. Morpholinos sont insensibles aux protéases ou de nucléases, aussi longtemps que l'eau que vous ajoutez est stérile, ils devraient être assez sûrs à température ambiante.
3. Avant d'injecter, incuber les morpholino à 65 ° C pendant 5 minutes pour l'assurer est complètement dissous, et laisser refroidir à température ambiante. NE PAS placer l'échantillon sur la glace. Gardez le morpholino à température ambiante jusqu'à l'injection.
4. Pour titrer un morpholino, nous préparent habituellement des dilutions en série de la concentration des stocks dans le trou DDH ₂ 0 pour obtenir des concentrations de travail de 1 mM, 0,5 mM, 0,25 mM et 0,125 mm. Selon la séquence, en utilisant 1,8 nl du volume d'injection, ce qui représente environ 20ng, 10ng, 5 ng, et 2.5ng de morpholino par injection. Ceci est juste un point de départ, puisque la tolérance et l'efficacité de chaque morpholino peuvent varier et ne peut pas être prédit. La plupart morpholinos ne sera pas toléré beaucoup au-dessus de 20 ng, mais certains peuvent être efficaces à des doses bien inférieures à 1 ng. Notre approche consiste à définir la concentration à laquelle un phénotype «plateaux». En d'autres termes, si un phénotype défini n'est pas vu à l'aide de 2,5 ng, mais il est similaire à l'aide de tout montant égal ou supérieur à 5 ng, nous choisirions de 5 ng comme un seuil. Bien sûr, il pourrait être utile pour titrer prochaine entre 2,5 ng et 5,0 ng, pour s'assurer que vous travaillez de manière reproductible au delà du seuil, plutôt que de droit "à la frontière".
5. Remplissez l'aiguille fixée et calibré(Voir ci-dessus) avec la plus faible concentration de travail (plus dilué) solution de morpholino. Évitez de trop remplir l'aiguille, comme il sera tout simplement les déchets matériels. Si vous remplissez seulement 1 pl, il ya suffisamment de solution pour 500 injections.
6. En utilisant une pipette jetable, le transfert d'une cellule fécondée-embryons dans les creux de la plaque de micro-injection. Retirer l'excès d'eau pour s'assurer que les embryons tombent au fond des creux d'injection. Ils ne doivent pas flotter, mais plutôt respecter le lit d'agarose.
7. Positionner la plaque d'injection afin que le micromanipulateur peut descendre l'aiguille à travers le chorion et dans le jaune pour l'injection. Pour positionner embryons individuels, manipuler la plaque d'injection telles que la pointe de l'aiguille d'injection pousse ou tire les embryons à la bonne position. Attention à ne pas briser la pointe de l'aiguille ou d'embryons dégâts! Cela prend un peu de pratique, mais comme une règle que vous utilisez le micromanipulateur simplement de déplacer l'aiguille d'injection dans l'embryon puis après l'injection, plutôt rapide et propre à. Les embryons sont mis en position d'injection en déplaçant la plaque à l'aide de votre main libre (main gauche si vous injectez avec votre main droite). Pour un nouvel apprenant, il est utile de pratiquer en utilisant une solution contenant 0,25% de rouge de phénol afin de visualiser la solution injectée. La confiance est également acquise par injection d'une solution contenant fluorescents marqués à microsphères (Molecular Probes, F-8794), pour confirmer que la solution a été injectée dans l'embryon, plutôt que de l'espace inter-chorion. Cependant, après quelques tours de la pratique, ces aides sont généralement plus nécessaires. C'est une bonne idée d'injecter de temps en temps en l'air, juste pour confirmer que l'aiguille n'est pas obstruée et que le volume injecté semble appropriée.
8. Embryons injectés sont transférés à un plat de Pétri 100mm avec de l'eau du système et cultivées à 28.5C. Après l'injection de la concentration minimale de service, toute solution restante peut être expulsé et l'autre plus forte concentration de travail de morpholino utilisé pour remplir l'aiguille. Répétez l'opération pour chaque concentration de morpholino. Bien qu'il soit possible de rincer l'eau à l'aide d'aiguilles, de tester un morpholino distinctes, nous préférons changer les aiguilles et les recalibrer. Soyez sûr de garder une cohorte d'embryons non-injecté pour vérifier si le lot spécifique d'embryons a été saine et normale.

Étape 3. La co-injection d'morpholinos à des doses seuil individuel

Le but du titrage effectué ci-dessus a été de définir une dose seuil pour chaque morpholino. Dans le meilleur des cas, essentiellement 100% de la morphants affiche un phénotype défini, si le gène ciblé est une fonction essentielle. Cependant, vous pouvez vous attendre une certaine variabilité due à une mauvaise injection artefacts. Avec la pratique, cela ne devrait pas dépasser 10%. Certains lots d'embryons (y compris les contrôles non-injecté) pourrait ne pas survivre bien, dans ce cas, l'expérience peut être nécessaire de actualisés. En attendant, il ya aussi la variabilité biologique, puisque des embryons individuels peuvent être plus ou moins tolérants à l'knockdown. Enfin, certains morpholinos peut juste pas être suffisamment efficaces pour atteindre un solide (pénétrant) knockdown. Si un phénotype est généré dans un faible pourcentage d'embryons, mais est reproductible, il peut être intéressant de tester un morpholino distinctes. Le but de cette expérience suivante consiste à déterminer si un phénotype tout à fait nouveau est vu quand les deux gènes sont ciblés simultanément. Nous ne sommes pas tout simplement à la recherche d'une augmentation du pourcentage d'embryons qui ont un phénotype morphant, mais plutôt pour la génération d'un phénotype distinct qui n'est pas vu au niveau ou au-dessus du seuil lors du test ou l'autre des gènes individuels.

1. Préparer un mélange de la combinaison de morpholinos testé précédemment, le seuil de concentration de chaque individu qui morpholino généré un phénotype défini. Par exemple, si le seuil pour chaque gène a été de 5 ng, préparer une solution de travail qui contiendra 5 ng + 5 ng de chacun (10 au total ng). Depuis embryons ne peuvent tolérer beaucoup plus de 20 ng morpholino total, il est important, sur la base des expériences précédentes, à utiliser la quantité minimale de chacun, qui est suffisante pour cibler efficacement chaque gène.
2. Les contrôles doivent comporter des séries d'embryons injectés avec chaque individu seul morpholino à la même concentration qui a été utilisé pour la combinaison. Les volumes de solution injectable doit être maintenu constant (par exemple 1,8 nl). Un grand avantage d'utiliser une souche journaliste est que vous pouvez évaluer le phénotype (par exemple une différenciation des cardiomyocytes) à tout moment, et à plusieurs reprises. Si les embryons doivent être évalués pour l'expression génique par hybridation in situ, stade appariés embryons et les contrôles peuvent être fixés à différents moments après l'injection. Pour notre expérimentation, nous allons évaluer l'expression de GFP comme un substitut à la différenciation des cardiomyocytes, à environ 24 HPF.

Étape 4. Evalorisation des phénotypes

1. Embryons injectés doivent être surveillés, juste après l'injection, et plusieurs fois pendant la journée, pour enlever toute embryons morts ou mourants, car ils peuvent compromettre la viabilité de l'morphants restantes. Pour évaluer l'expression du gène rapporteur, les embryons sont examinés en utilisant un microscope à dissection équipé avec une capacité de fluorescence. Nous utilisons un microscope Nikon SMZ1500, avec un objectif 1X ou 1,6 X et une gamme de grossissement de 0,75 x à partir de 11.25x. Lorsque vous utilisez un filtre fluorescentes, assurez-vous d'ouvrir le diaphragme à l'établissement complètement ouverte afin de maximiser l'intensité lumineuse. Veillez également à utiliser le filtre approprié, en fonction du gène rapporteur (GFP, RFP, etc.)
2. Les embryons sont habituellement sous sédation en utilisant une dilution 1 / 20 dans l'eau du système de stock 4mg/ml de méthanesulfonate tricaïne. Les stocks sont conservés congelés à-20C. Alternativement, les embryons peuvent être euthanasiés en utilisant le stock 20x tricaïne. Les embryons peuvent généralement être projeté, même si elles sont encore dans le chorion. Cependant, surtout si elles seront photographiés, il est une bonne idée de supprimer l'aide d'une pince chorions forte. Les embryons peuvent être consultés après la mise en diapositives dépression dans la solution tricaïne, ou pour mieux les immobiliser pour la photographie placée dans une petite goutte de 3% de méthylcellulose.
3. Observez phénotypes embryon dans ceux injectés avec la combinaison de morpholinos rapport à morphants unique. Ici, nous sommes à la recherche du modèle d'expression de la GFP dans le tube cardiaque primitif. Dans cette souche GFP rapporteur est exprimé exclusivement dans les cardiomyocytes via le promoteur cmlc2, ce qui permet une analyse détaillée de la spécification cardiaque et la morphogenèse du tube cardiaque.

Les résultats représentatifs

Dans notre expérience, les deux gata5 et gata6 morphants seule montrent reproductibles phénotypes cardiaques lorsqu'il est injecté avec des niveaux de seuil, mais il est considérable variabilité biologique ^3,4. Par exemple, la plupart des gata5 morphants générer un coeur bifides, avec expression de la GFP situés dans deux régions. Cela se produit parce que les progéniteurs cardiaques ne parviennent pas à migrer correctement à fusibles sur la ligne médiane lors de la formation du tube cardiaque. Toutefois, certains des gata5 morphants génèrent un tube cardiaque défectueuse, et dans un petit nombre (5%) il ya une diminution significative de la quantité de cellules GFP +. Nous croyons que cela reflète la variabilité biologique, mais peut aussi être dû au fait que morpholinos ne sont pas équivalentes à un "null" mutation.

De même, le gata6 morphants montrent tous un phénotype cardiaque, mais il ya toute une gamme de phénotypes dont un petit nombre de bifides réchauffe, et les cœurs qui sont perturbés morphologiques par rapport à la non-injecté embryons témoins. Cette variabilité n'est pas inhabituel pour un phénotype morphogénétiques cardiaque, depuis la formation du cœur est un processus dynamique et au moins certains de le phénotype cardiaque peut être due indirectement de défauts morphogénétiques embryonnaire. Cependant, fait important, la gamme d'anomalies morphogénétiques cardiaque pour morphants deux gata5 et gata6 est cohérent et reproductible, et pour la plupart, les embryons générer des cellules GFP + cardiomyocytes.

En contraste frappant avec la gata5 et gata6 morphants unique, appauvri embryons des deux facteurs montrent une perte complète de l'expression de GFP, compatible avec une perte de cardiomyocytes. Ainsi, gata5 et gata6 ont chacune non redondante des fonctions pour la morphogenèse cardiaque, mais les deux gènes sont fonctionnellement redondantes dans une exigence pour la génération de cardiomyocytes différenciés. Nos études antérieures ont montré également une perte des premiers marqueurs des cardiomyocytes, y compris Nkx2.5, suggérant une exigence pour la spécification des cardiomyocytes ^3.

Discussion

Dans l'expérience décrite ici, on a combiné deux morpholinos, chacune d'elles génèrent à eux seuls une gamme distincte de phénotypes, et a trouvé un phénotype tout à fait différent quand ils ont été co-injectés ensemble. Bien sûr, nous avions besoin d'une justification pour faire cette expérience, en premier lieu. Nous supposions que les deux gènes pourraient compenser les uns les autres pour une fonction plus tôt, dans cette spécification cas cardiaques. C'est parce que les gènes sont fortement liés (et capable de se lier à des séquences d'ADN identiques) et sont exprimés en chevauchant cours de l'embryogenèse ^5. Par ailleurs, des expériences génétiques chez la drosophile ont indiqué que les facteurs de transcription GATA devrait être requise pour la spécification cardiaque ^6.

Cependant, il ya d'autres situations que cette stratégie pourrait être utilisée pour tester la redondance fonctionnelle ou plus généralement pour les interactions génétiques. Tout d'abord, knockdown de l'un ou les deux gènes pourraient ne génère aucun phénotype évident. Dans ce cas, il n'ya pas de seuil défini pour chaque gène, et le montant des morpholino à utiliser seront définies de manière empirique, limitée par la façon dont ils sont tolérés par les embryons. Encore une fois, la justification de la rémunération des tests seront probablement que les gènes sont fortement liés et de confirmer la co-expression de motifs. Deuxièmement, les interactions génétiques peuvent être testés pour toute paire de gènes en utilisant des sous-seuil de quantités de morpholinos. Dans cette stratégie, le montant maximal qui ne génère pas un phénotype est utilisé pour chaque morpholino. Si combinant à la fois morpholinos génère un phénotype, cela fournit une preuve solide pour une interaction génétique, même si elle peut être assez indirecte ou même à représenter les voies parallèles. Troisièmement, la co-injection d'un morpholino seconde peut sauver le phénotype de la première, si les deux gènes interagissent de façon antagoniste (qui encore une fois peut être indirecte). Bien qu'il n'y ait pas de limite définie pour le nombre de gènes différents peuvent être ciblés, dans un sens pratique, il est probablement gènes 3-4, en fonction du montant de chaque morpholino qui est nécessaire pour un seuil de réponse.

Bien que cette approche générale de l'utilisation de la génétique inverse pour révéler les fonctions des gènes est relativement nouvelle à haut-débit, il ya un certain nombre de réserves à considérer concernant morpholinos. Avant de combiner morpholinos, des efforts considérables sont nécessaires pour valider les réactifs individuels, si cela n'a pas déjà été accompli. Toute seule morpholino peuvent ne pas fonctionner, tandis que d'autres peuvent générer des hors-cible "artefact" phénotypes particulièrement associé à l'activation de l'apoptose répandue. Les réactifs sont pas bon marché, et si deux ou plusieurs morpholinos sont nécessaires pour valider chaque gène, cet investissement peut être considérable.

Plusieurs considérations peuvent guider la stratégie expérimentale.

i) Y at-il un phénotype mutant connus? Si oui, une seule copie phé-morpholino devrait être suffisant.

ii) Y at-il un anticorps disponibles? Si c'est le cas, une traduction-bloquant peut être préférée, et si non, il sera important de documenter que d'une épissure-bloquant efficacement les objectifs de pré-ARNm.

iii) Pouvez-vous sauver les morphant par injection d'ARNm? Si cela fonctionne, il offre d'excellentes preuves de la spécificité morpholino. Cependant, il peut souvent pas de travail, suite à un mauvais ciblage de l'ARNm injecté. Rescue peut aussi être testée à l'aide basé sur le transposon transgénèse, puisque cela peut permettre un contrôle plus strict spatiale et temporelle sur l'expression du gène ciblé. Dans les deux cas, il est important de s'assurer que le gène de sauvetage n'est pas visé par la morpholino.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fish breeder tanks and dividers	Aquatic Habitats
Fish nets	Aquatic Habitats
System water			60mg Instant Ocean” per liter dH2O
100mm Petri dishes	BD Biosciences	351029
Micropipette needle puller	Sutter Instrument Co.	P-97 Flaming/Brown
3.5" glass capillaries	Drummond Scientific	3-000-203-G/X
Razor blade	Personna Medical Care	94-120-71
Micro grinder	Narishige International	EG-4
Gridded microscope eyepiece	Premiere	MF-02
Micrometer	WARD’s Natural Science	94 W 9910
Ultrapure agarose	Invitrogen	15510-027
Spatula	Fisher Scientific	14-357Q
Scale	Mettler Toledo	AB54-S/FACT
Disposable weigh dishes	Fisher Scientific	2-202-B
Conventional microwave	GE Healthcare
Erlenmeyer flask	Corning	4980
Microscope slides	Fisher Scientific	12-552
Graduated cylinder	Fisher Scientific	08-572-6D
Automatic pipette man	BrandTech	2026333
70% ethanol wash solution	Tarr	801VWR
N2 tank	Tech Air
Microinjector	Harvard Apparatus	PLI-100
Micromanipulator	Micro Instruments	LTD
Dissecting microscope	Nikon Instruments	SMZ1500
Parafilm	American National Can	PM-992
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M5904
Kimwipes	Kimberly-Clark Corporation	34155
gata5 splice site morpholino	Genetools, LLC		5’-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3’
gata5 ATG Blocker	Genetools, LLC		5’-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3’
gata6 Long Isoform ATG Blocker	Genetools, LLC		5’-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3’
Disposable Pasteur Pipette	Fisher Scientific	13-678-20B
Tricaine Methanesulfonate	Argent Labs	MS-222
Methycellulose	ICN Biomedicals	155495
Heat Block	Fisher Scientific	11-718-4
Sharp forceps	Dumont		Size 55
Depression Microslides	VWR international	48339-009