Ortotopico Hind-Limb trapianto in topi

Summary

Qui si descrive il ratto ortotopico arti posteriori procedura di trapianto, che sembra essere il gold standard

Abstract

Allotrapianto tessuto composito (CTA) rappresenta oggi una valida opzione terapeutica dopo la perdita di un avambraccio mano, o le cifre ed è diventato un'entità romanzo terapeutico nella chirurgia ricostruttiva. Tuttavia, a lungo termine ad alto dosaggio multi-farmaco terapia immunosoppressiva è necessaria per garantire la sopravvivenza del trapianto, con il rischio di gravi effetti collaterali che cavezza una più ampia applicazione. Ulteriore progressione in questo campo può dipendere da una migliore comprensione di base di immunologia e di ischemia riperfusione in innesti di tessuto composito.

Ad oggi, il trapianto ortotopico degli arti posteriori nei ratti è stato preferito il modello roditore per ricostruttiva trapianto (RT), tuttavia, è una procedura estremamente esigente che richiede competenze di microchirurgia straordinario per riattacco di vasi, ossa, muscoli e nervi.

Abbiamo introdotto la tecnica di anastomosi vascolari bracciale a questo modello, fornendo un approccio rapido e affidabile per ratto trapianto degli arti posteriori. Questa tecnica semplifica e accorcia la procedura chirurgica e consente ai chirurghi con esperienza di microchirurgia di base per svolgere con successo l'operazione con la sopravvivenza alto e basso tasso di complicanze. La tecnica sembra essere adatto per immunologici e ischemia riperfusione (IRI) studi.

Protocol

Operazione dei donatori e Hind-Limb Harvest

1. Per la procedura operativa un insieme sterile di strumenti di microchirurgia viene utilizzato. Il chirurgo deve indossare abbigliamento adeguato compresi i guanti sterili, che devono essere modificati prima dell'inizio della procedura chirurgica.
2. Il ratto è anestetizzato con un'iniezione intraperitoneale di pentobarbital (IP 50mg/kg) e posto in posizione supina su un campo riscaldato operazione, che facilita una stabile la temperatura corporea degli animali durante tutta la procedura chirurgica.
3. Prima incisione cutanea l'depositato di funzionamento è sterilizzata tre volte con entrambi, un disinfettante e alcol. Per evitare che le cornee animali si secchi, gli occhi sono lubrificati con una pomata oftalmica (Vidisic) prima dell'intervento.
4. Una incisione cutanea è fatta attraverso l'inguine destro circa a livello del legamento inguinale. I vasi femorali sono sezionati libero con cauterizzazione bipolare e dissezione smussa; rami profondi sono legatura con 8-0 seta.
5. 300μl (50 UI) di eparina sono iniettati attraverso la vena del pene per l'anti-coagulazione.
6. Vasi femorali sono legatura a livello del legamento inguinale e tagliato distalmente alla legatura.
7. L'arto posteriore viene lavata con ghiaccio freddo (4 ° C) soluzione HTK (5ml) attraverso l'arteria femorale più di 5 minuti.
8. Tutti i gruppi muscolari sono nettamente divise con le forbici e osteotomia viene eseguita con una sega elettrica a rotazione a livello del terzo distale del femore.
9. L'arto raccolto viene poi immerso in 20 mL di soluzione ghiacciata HTK per la conservazione e lo stoccaggio a freddo fino a trapianto.

Destinatario di funzionamento e Trapianto

1. Il ratto è anestetizzato con un'iniezione intraperitoneale di pentobarbital e posto in posizione supina sul campo operativo.
2. Una incisione cutanea è fatta attraverso l'inguine destro circa a livello del legamento inguinale. I vasi femorali sono sezionati libero con cauterizzazione bipolare e una dissezione smussa.
3. Vasi femorali sono legatura distale come possibile, ma in prossimità del decollo nave epigastrico. Pinze vascolari sono collocati a livello del legamento inguinale sulla arteria e vena.
4. Un bracciale in polietilene è tirato su l'arteria (diametro interno della cuffia: 0,912 millimetri, bracciale-spessore: 0,010 mm, lunghezza bracciale: 2,0 mm) e la vena (diametro interno della cuffia: 1,151 millimetri; gemelli spessore: 0,010 mm, lunghezza bracciale : 2,0 mm). Il bordo del lume del vaso viene poi tirato con un vaso dilatatore e l'arteria femorale e la vena sono estroflesso su tutto il corpo della cuffia (circa 2 mm) e fissato con una legatura circonferenziale 8-0 seta.
5. Per fare spazio per l'arto donatore l'arto destinatario viene rimosso con dissezione acuto di gruppi muscolari e osteotomia viene eseguita a metà del femore.
6. L'arto donatore viene rimosso dalla soluzione HTK e il trapianto inizia con osteosintesi del femore con un ago calibro 18 (lunghezza: 1,5-2,0 cm) come una bacchetta intramidollare.
7. Gruppi di muscoli ventrali sono strettamente approssimato con Vicryl 4-0 o Prolene punti staccati.
8. Anastomosi vascolari vengono eseguite tirando la vena del donatore e l'arteria oltre la vena destinatari e complessa della cuffia. Un circonferenziale 8-0 legatura in seta è di nuovo in grado di assicurare l'anastomosi.
9. Il morsetto venoso viene rilasciato seguita dalla pinza arteriosa, e la riperfusione è visualizzato dal ritorno di colore alla distali degli arti e del piede, così come il flusso pulsatile attraverso l'arteria.
10. Restanti gruppi muscolari dorsali sono ri-approssimato con Vicryl 4-0 o Prolene punti staccati.
11. La pelle è chiusa con Vicryl 4-0 o prolene punti staccati.
12. Il ratto destinatario è collocato su una piastra elettrica e strettamente monitorati fino al recupero.
13. Animali destinatario ricevere profilassi antibiotica (Cefazolina, 20 mg / die, IM) e Buprenex (0,1 mg / kg, SC) per tre giorni post-trapianto.

Discussion

Decenni di ricerche sperimentali hanno preceduto e permesso di successo il trapianto di mano umana nel recente passato. Nel 1978, Shapiro et al. sviluppato un modello di trapianto ortotopico posteriori degli arti nei ratti, adatto per studiare vari aspetti patologici, fisiologici e immunologici così come risultato funzionale di innesti di tessuto composito. Abbiamo modificato la parte più impegnativa della procedura, vale a dire l'anastomosi vascolari, con l'introduzione di un non-tecnica di sutura della cuffia. Rispetto alla tecnica di sutura tradizionale che semplifica e accorcia la procedura chirurgica e consente ai chirurghi con esperienza di microchirurgia di base per svolgere la procedura con un elevato tasso di sopravvivenza (80-90%).

Senza la variabilità delle anastomosi suturato, il rischio di sanguinamento, trombosi e attorcigliamenti del peduncolo sono diminuiti. Costrizione o turbolenza nel sito in cui il sangue si scontra inizialmente con il lume che passa attraverso il bracciale è un nuovo rischio potenziale della tecnica della cuffia, anche se questo può essere minimizzato con un'opportuna scelta dimensioni del bracciale. Inoltre, discordanze di piccole dimensioni possono essere facilmente gestiti con anastomosi bracciale, riducendo ulteriormente il rischio intrinseco di sutura vasi di diverso diametro. Alcune delle considerazioni più significative per una anastomosi bracciale di successo sono i seguenti:

1. Una singola iniezione di Pentobarbital (50 mg / kg, IP) dovrebbe essere sufficiente per anestetizzare l'animale per 90 minuti. Nel caso l'operazione dura più di 70-80 minuti una dose aggiuntiva di IP 15mg/kg dovrebbero essere applicate. Profondità dell'anestesia può essere testato durante l'intervento ripetendo la punta-pinch test di riflesso.
2. L'osteotomia del donatore arti posteriori / destinatario degli arti posteriori deve essere eseguita a metà femore per alleviare osteosintesi durante il trapianto.
3. Un'attenta selezione di dimensioni bracciale è di importanza cruciale per il successo rivascolarizzazione.
4. Per evitare trombosi, eparina (50IU) deve essere somministrata al minuto donatore 1 prima di perfusione innesto.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nembutal®	OVATION Pharmaceuticals
Heparin Immuno	Ebewe Pharma
Custodiol HTK Solution	Essential Pharmaceuticals
Adventitia Scissors	ASSI	ASSI®SAS-21 R-8T
Forceps	ASSI	ASSI®JFC-7
Dilator Forceps	ASSI	ASSI®D-5AZ
Polymide Tubes	River Tech Medical	#17; #19