حقن الوريد البابي: طريقة لدراسة ورم خبيث سرطاني في الكبد

Abstract

المصدر: Goddard ، E. T. ، وآخرون. نموذج حقن الوريد البابي لدراسة ورم خبيث في الكبد لسرطان الثدي. J. Vis. Exp. (2016).

يصف هذا الفيديو إجراء جراحيا لتوصيل خلايا ورم الثدي إلى كبد الفئران عن طريق حقن الوريد البابي. يسمح هذا النموذج بالتحقيق في المراحل المتأخرة من ورم خبيث في الكبد.

Protocol

< p class = "jove_title" >1. تحضير المنطقة الجراحية والأدوات

1. تحضير المقص والملقط والهيموسات عن طريق التعقيم عند 124 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، 1-2 أيام قبل العمليات الجراحية المخطط لها. تأكد من الوصول إلى الفراش والأقفاص والطعام المعقمة أو المعقمة للتعافي بعد الجراحة.
2. قم بإعداد منطقة جراحية معقمة ، ويفضل أن يكون ذلك في غطاء التدفق الصفيحي.
   1. امسح جميع أسطح المنطقة الجراحية باستخدام مبيض بنسبة 10٪ ، بما في ذلك وسادة التدفئة ومصدر الضوء وأنبوب التخدير ومخروط الأنف وأي جزء آخر من الجناح الجراحي سيكون على مقربة من العملية الجراحية أثناء إجرائها.
   2. في المنطقة الجراحية المعقمة ، ضع وسادة التدفئة النظيفة مع ستارة معقمة ، ومصدر الضوء ، وأنابيب التخدير ومخروط الأنف ، ومحاقن الأنسولين ، ومحاقن 1 مل ، وبوبيفاكائين ، والدموع الاصطناعية ، والمحلول الملحي المعقم ، وإسفنج شاش معقم 2 × 2 بوصة ، وشاش معقم 4 × 4 بوصة ، وشاش مرقئ مقطوع إلى قطع 0.5 - 1 سم 2 ، مقص ، ملقط ، مرقئ ، خيوط فيكريل 4-0 مع إبرة مستدقة ، و 50 مل غلوكونات الكلورهيكسيدين 2٪ في حاوية معقمة.
   3. تأكد من وجود مساحة في هذه المساحة للخلايا السرطانية المحضرة المخزنة على الجليد.
   4. على المقعد المجاور للمنطقة الجراحية ، قم بإعداد منطقة التعافي بوسادة تدفئة ثانية وأقفاص نظيفة بفراش معقم.
      ملاحظه: يمكن أن تحتوي هذه المنطقة أيضا على عناصر مثل معقم الخرز.

2. حقن الوريد البوابي

1. قبل ساعة واحدة من الحقن المخطط لها ، عالج إناث Balb / c الفئران التي تتراوح أعمارها بين 8 و 15 أسبوعا ب 100 ميكرولتر من 0.015 مجم / مل بوبرينورفين ، تحت الجلد ، لإدارة الألم.
   ملاحظه: يمكن تطبيق بروتوكول الحقن هذا على أي سلالة من الإناث أو الذكور من الفأر في أي عمر, باستخدام خطوط الخلايا المناسبة للتغييرات في السلالة.
2. تحضير الخلايا السرطانية للحقن بناء على بروتوكولات خط الخلية أو نبات الورم المفضل. اختبر جميع خطوط الخلايا السرطانية قبل تناولها بحثا عن وجود مسببات الأمراض في الفئران لتقليل خطر إدخال مثل هذه مسببات الأمراض إلى مستعمرة.
   1. بالنسبة لخطوط الخلايا السرطانية المولدة Balb / c المتجانسة بما في ذلك الخلايا السرطانية D2A1 و D2.OR و 4T1 ، قم بإذابة الخلايا في صفيحة زراعة الأنسجة مقاس 10 سم قبل 3 أيام من الحقن بحيث تكون خلايا اليوم التالي عند ~ 90 - 100٪ من التقاء.
   2. بعد يوم واحد من إذابة الخلايا السرطانية ، اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (PBS) وقم بتربسين الخلايا السرطانية المتقاربة باستخدام 2 مل من 0.05٪ تريبسين عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. أضف 8 مل من الوسائط الكاملة (DMEM نسبة عالية من الجلوكوز ، ومصل الأبقار الجنينية بنسبة 10٪ ، و 2 ملي مولار L-glutamine ، و 1x البنسلين / الستربتومايسين) وقم بتمرير 1:10 إلى طبق طازج مقاس 10 سم مع 10 مل من الوسائط الكاملة.
   3. في يوم الحقن ، اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 1x PBS والتربسين كما هو موضح أعلاه.
   4. قم بإعادة تعليق الخلايا المثقببة في 8 مل من الوسائط الكاملة ، وتدور لمدة 5 دقائق عند 1,500 × جم ، وقم بإزالة الوسائط وإعادة تعليقها في 5 مل 1x PBS.
   5. عد الخلايا على مقياس كثافة الدم باستخدام استبعاد التريبان الأزرق لتقييم الجدوى. إعادة تعليق الخلايا للحقن في 1x PBS بتركيز وحجم محددين مسبقا.
      ملاحظة: يوصى باستخدام 5 - 10 ميكرولتر لأن أحجام الحقن الأصغر تمنع الضرر غير الضروري للكبد.
   6. احتفظ بالخلايا على الجليد طوال مدة الحقن. بعد الانتهاء من الحقن ، أعد عينة من الخلايا إلى المختبر وضعها في المزرعة في وسائط كاملة لمدة يوم واحد لضمان البقاء.
3. ضع الفأر تحت التخدير مع 2 - 2.5٪ إيزوفلوران (2-كلورو-2- (ثنائي فلوروميثوكسي) -1،1،1-ثلاثي فلورو إيثان) يتم توصيله في الأكسجين. حافظ على درجة حرارة الجسم باستخدام وسادة التدفئة. تأكد من التخدير الكامل عن طريق تقييم رد الفعل على قرص إصبع القدم ، ثم حافظ على التخدير عند 2 - 2.5٪ إيزوفلوران.
   ملاحظه: من المهم مراقبة معدل تنفس وضبط معدل تدفق الأيزوفلوران وفقا لذلك طوال العملية.
4. ضع كمية صغيرة من الدموع الاصطناعية أو مرهم بيطري على كل عين لتجنب الجفاف المفرط للعينين أثناء العملية الجراحية.
5. ضع الفأر في وضع ضعيف ، على ظهره مع كشف البطن.
6. قم بإزالة الشعر على الجانب الأيسر البطني من القوارض من مساحة الضلع الثاني وصولا إلى حلمة الغدة الثديية الأربية الرابعة عن طريق مسح المنطقة بإزالة الشعر الكيميائية. اترك مزيل الشعر لمدة 1-2 دقيقة ثم قم بإزالته تماما باستخدام الشاش و H2O. يمكن القيام بهذه الخطوة قبل 1-2 أيام لتوفير الوقت إذا تم التخطيط للعديد من العمليات الجراحية.
7. خذ إسفنجة شاش معقمة مقاس 2 × 2 بوصة (مبللة ب 2٪ كلورهيكسيدين) وامسح الماوس في موقع إزالة الشعر. تعقيم المنطقة المحيطة بأكملها ، بما في ذلك الذيل ، لتقليل التلوث البكتيري للأدوات.
8. امسح موقع إزالة الشعر والمنطقة المحيطة به باستخدام وسادة تحضير الكحول.
9. كرر خطوات الكلورهيكسيدين والكحول بنسبة 2٪ مرة أخرى وانتهي بمسح الكلورهيكسيدين النهائي ليصبح المجموع ثلاث غسلات من الكلورهيكسيدين بنسبة 2٪ وغسلتين من وسادة تحضير الكحول. قم بمسح الكلورهيكسيدين النهائي بحيث لا تتساقط المادة الكيميائية حول موقع الجراحة لتجنب الحصول على الكلورهيكسيدين على الأعضاء الداخلية.
   ملاحظه: قد يؤدي تطبيق كميات كبيرة من الكلورهيكسيدين والكحول على الجلد والفراء المحيط به إلى انخفاض كبير في درجة حرارة الجسم. لا تمسح بحجم زائد خلال الخطوات 2.7-2.9. حافظ على درجة حرارة الجسم باستخدام وسادة التدفئة.
10. باستخدام قفازات معقمة ومشرط معقم بشفرة معقمة ، قم بعمل شق واحد بحجم 1 بوصة في الجلد بين المستويين المتوسط والسهمي على الجانب الأيسر من الفأر ، بدءا من أسفل الأضلاع مباشرة وينتهي فوق مستوى حلمة الغدة الثديية الأربية الرابعة.
11. باستخدام مقص وملقط معقم أو معقم بالخرز ، قم بعمل شق مماثل بحجم 1 بوصة في الصفاق. تجنب قطع وسادة دهون الثدي وتأكد من عدم قطع الأمعاء أو الكبد أو الحجاب الحاجز.
12. ضع وسادة شاش مقاس 4 × 4 بوصات مبللة بمحلول ملحي معقم على الجانب الأيسر من الفأر ، حيث تم إجراء الشق ، بحيث يمكن وضع الأعضاء الداخلية على الشاش وعدم ملامسة الجلد المحيط أو المنطقة الجراحية.
13. قم بإعداد الخلايا السرطانية عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل عدة مرات حيث ستستقر الخلايا السرطانية أثناء تحضير الفأر. قم بإعداد حقنة إبرة قابلة للإزالة سعة 25 ميكرولتر وإبرة قياس 32 مع الخلايا السرطانية. اضغط على المحقنة حتى تصبح الخلايا السرطانية في طرف الإبرة ويكون المكبس في الحجم المناسب للحقن ؛ تجنب حقن فقاعات الهواء.
14. امسح الجزء الخارجي من الإبرة بقطعة كحول معقمة لإزالة أي خلايا سرطانية خارجية. توخي الحذر لتجنب الوخز الإبر.
15. أمسك الجانب المتوسط من الشق ، بما في ذلك الجلد والبطانة البريتونية ، جانبا مع الملقط واستخدم قطعة قطن معقمة لسحب الأمعاء الغليظة والدقيقة بعناية ، ووضعها على الشاش المعقم المنقوع في محلول ملحي معقم. اسحب الأمعاء الغليظة والدقيقة حتى يتم تصور الوريد البابي.
16. قم بتغطية الأعضاء الداخلية في الشاش المنقوع بالمحلول الملحي للحفاظ على الرطوبة الداخلية والعقم.
17. اطلب من مساعد ، يرتدي أيضا قفازات معقمة ، أن يمسك الأمعاء ملفوفة في الشاش المنقوع بالمحلول الملحي برفق بعيدا عن الطريق باستخدام مسحة قطنية معقمة للكشف عن الوريد البابي بالكامل. بالإضافة إلى ذلك ، قد يكون من الضروري استخدام الترقيق أو الملقط المعقم لتثبيت الأنسجة جانبا على الجانب المتوسط من الشق.
18. أدخل الإبرة المحملة بالخلايا السرطانية ~ 3 - 5 مم في الوريد البابي ~ 10 مم أسفل الكبد بزاوية < 5 درجات للوريد ، مع توجيه شطبة لأعلى. حقن الحجم الكامل الذي يحتوي على الخلايا السرطانية ببطء. اسمح للدم بالتدفق عبر رأس الإبرة لعدة ثوان لتجنب التدفق العكسي للخلايا السرطانية خارج الوريد. قلل من تحريك الإبرة في الوريد أثناء الحقن. مرة أخرى ، توخي الحذر لتجنب العصي الإبرة.
    ملاحظه: يتم تصور الوريد البابي بدون تكبير ، ولكن يمكن استخدام مجهر مجسم إذا كنت تفضل ذلك.
19. قم بإزالة الإبرة مع وضع قضيب طرف قطني معقم على الوريد مع الضغط. مع استمرار المساعد في تثبيت الأمعاء جانبا ، ضع قطعة واحدة من 0.5 - 1 سم 2 شاش مرقئ فوق موقع الحقن على الوريد.
    ملاحظه: تمت محاولة مسحوق مرقئ أيضا لهذه الخطوة في البروتوكول ولكنه لم يكن فعالا في وقف فقدان الدم الوريدي بعد الحقن.
20. أمسك الشاش المرقئ في موقع الحقن بضغط من قضيب طرف قطني معقم لمدة 5 دقائق.
21. قم بتقييم إغلاق الوريد عن طريق رفع الشاش المرقئ بعناية ، إذا التصق الشاش بالأنسجة المحيطة ، فيمكن استخدام كمية صغيرة من المحلول الملحي المعقم لامتصاص الشاش ورفعه.
22. في حالة حدوث فقدان الدم في هذا الوقت ، ضع قطعة إضافية من الشاش المرقئ في الموقع مع الضغط لمدة 5 دقائق إضافية. عندما يتوقف تدفق الدم تماما ، قم بإزالة الشاش من الماوس.
    ملاحظه: يجب تقييم فقدان الدم أثناء العملية الجراحية بعناية ، وإذا تم استيفاء إجمالي حجم فقدان الدم المسموح به أو تجاوزه (بناء على إجراءات التشغيل القياسية التنظيمية لمجالس المراجعة المؤسسية للمحقق) ، فيجب القتل الرحيم للفأر أثناء التخدير عن طريق التروية القلبية.
23. بمجرد اعتبار موقع الحقن سليما ، مع عدم مغادرة أي دم لموقع الحقن ، ضع الأعضاء الداخلية برفق مرة أخرى في تجويف البطن.
24. خياطة البطانة البريتونية ثم الجلد بخياطة فيكريل معقمة 4-0 وإبرة مستدقة باستخدام نمط خياطة بسيط أو مستمر أو متقطع. عادة ما يتطلب إغلاق الشق 10-15 خياطة.
25. حقن 100 ميكرولتر من بوبيفاكائين (5 ملغ/مل) على طول موقع الشق للتحكم في الألم الموضعي باستخدام حقنة الأنسولين. حقن 0.5 مل من محلول ملحي معقم تحت الجلد باستخدام حقنة سعة 1 مل بإبرة قياس 26 للترطيب. تستغرق العمليات الجراحية من 15 إلى 25 دقيقة حتى تكتمل.
26. للحفاظ على ظروف معقمة طوال الجراحة، تأكد من تنظيف جميع الأدوات والمواد التي تتلامس مع الفأر، بما في ذلك الأيدي التي ترتدي القفازات، بشكل مناسب قبل ملامستها. حيثما أمكن ، استخدم مواد وقفازات معقمة ، أو استخدم الحد الأدنى من محلول الإيثانول بنسبة 70٪ أو محلول مبيض بنسبة 10٪ للتنظيف.
27. إذا تم التخطيط لعمليات جراحية متعددة لجلسة واحدة ، فقم بإعادة تشكيل المنطقة الجراحية الأولية باستخدام ستارة معقمة جديدة ، ومحاقن الأنسولين ، ومحاقن 1 مل ، ومحلول ملحي معقم ، وإسفنج شاش معقم 2 × 2 بوصة ، وشاش معقم 4 × 4 بوصة ، وشاش مرقئ مقطع إلى قطع 0.5 - 1 سم 2 ، وخيوط فيكريل 4-0 بإبرة مستدقة ، و 2٪ كلورهيكسيدين. قم بتعقيم المقص والملقط والهيموسات بين العمليات الجراحية واتركها لتبرد بشكل كاف قبل إعادة الاستخدام.

Materials

List of materials used in this article Name Company Catalog Number Comments 1 مل حقنة مع إبرة قياس 26 حقنة BD 309597 309597 منصات تحضير الكحول فيشر ساينتيك 06-669-62 لتنظيف البطن قبل الشق الجراحي إسفنج لجميع الأغراض ، معقم كندال 8044 4 "× 4" ، استخدم مغموسة في محلول ملحي معقم للحفاظ على الأمعاء الغليظة والدقيقة محمية وترطيبها أثناء الجراحة الدموع الاصطناعية الركبي 370114 زيت معدني 15٪ ، فازلين أبيض 83٪ ؛ يستخدم لحماية العينين أثناء الجراحة بوبرينورفين حمض الهيدروكلوريك ، 0.3 مجم / مل Mfg. بواسطة ريكيت بينكيزر NDC-12496-0757-1 يستخدم عند 0.05 - 0.1 ملغ/كغ من وزن الجسم، 1-2 مرة يوميا لمدة 72 ساعة، بالحقن تحت الجلد بوبيفاكائين حمض الهيدروكلوريك، 0.5٪ (5 ملغ/مل) Mfg. بواسطة Humira Inc NDC-04091163-01 يستخدم بنسبة 0.5٪ ، 1x مباشرة بعد الجراحة ، 10 ميكرولتر تحت الجلد في موقع الشق شاش مرقئ سريع من Celox™ منتجات ميدتريد المحدودة FG08839011 تقطع إلى قطع بحجم 5 مم² ، وتستخدم لوقف تدفق الدم خارج الوريد البابي بالضغط بعد الحقن الكلورهيكسيدين ، محلول 2٪ طبيب بيطري واحد 1CHL008 توخي الحذر ، لا تحصل على الكلورهيكسيدين في الأغشية المخاطية أو آذان الفأر أدوات تطبيق قطنية برأس, معقمة فيشر ساينتيك 23-400-114 6 "عمود خشبي 2 قطعة / مغلف DMEM، نسبة عالية من الجلوكوز HyClone SH30243.01 قاعدة وسائط زراعة الخلايا للاستخدام مع خطوط الخلايا الورمية الثديية D2A1 و D2.OR و 4T1 معقم حبة الزجاج الجاف استخدم بين العمليات الجراحية لتعقيم أدوات الفولاذ المقاوم للصدأ ، وتوخي الحذر ، والساخن للغاية ؛ موردين متعددين الإيثانول ، محلول 70٪ توخي الحذر القابل للاشتعال ؛ استخدم لتنظيف المنطقة الجراحية حسب الحاجة ؛ موردين متعددين مصل الأبقار الجنينية HyClone SH30071.03 مادة مضافة لوسائط زراعة الخلايا للاستخدام مع D2A1 و D2.OR و 4T1 Journal of Visualized Experiments www.jove.com حقوق الطبع والنشر © لعام 2016 Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 صفحة الترخيص غير المنقولة الصفحة 2 من 3 خطوط خلايا ورم الثدي ، تستخدم بنسبة 10٪ في نسبة الجلوكوز المرتفعة DMEM شاش معقم كندال 2146 2 × 2 بوصة ، استخدم مغموسة في محلول الكلورهيكسيدين 2٪ لتنظيف البطن قبل الشق الجراحي إيزوفلوران بيرامال NDC-66794-017-25 تدار بنسبة 2.5٪ مبخر الأيزوفلوران فيكيب 911103 توخي الحذر ، يبخر غازات التخدير حقنة إبرة قابلة للإزالة، 25 ميكرولتر، موديل 1702 هاملتون 7654-01 لحقن الوريد البابي ؛ توخي الحذر ، بشكل جزئي أثناء العمل مع الإبر المحملة بالخلايا السرطانية ، حادة عند توصيل الإبرة مقبض مشرط الفولاذ المقاوم للصدأ متعدد الموردين شفرة مشرط، #15 الكربون الصلب ، معقم ، حجم 15 ؛ موردين متعددين إبر قابلة للإزالة ذات محور صغير ، مقياس 32 هاملتون 7803-04 لحقن الوريد البابي ، يمكن أيضا استخدام الإبر القابلة لإعادة الاستخدام بطول 1 بوصة ، ونمط النقطة 4 ، وزاوية 12 درجة ، وقياس 33 إلى 34 ؛ توخي الحذر ، بشكل جزئي أثناء العمل مع الإبر المحملة بخلايا الورم ، حادة محلول ملحي معقم فيشر ساينتيك ص358-212 محلول كلوريد الصوديوم 0.9٪ ؛ بدلا من ذلك ، يمكن تصفيته محلية الصنع ومعقمة قفازات جراحية معقمة موردين متعددين خيوط معقمة إيثيكون J310H 4-0 27 "المغلفة فيكريل ث / 22 مم 1 / 2C تفتق إبرة الإيثوايلي. توخي الحذر ، حاد آلة التخدير المحمولة على الطاولة فيكيب 901801 استخدم مع مبخر الأيزوفلوران لتخدير الفأر ملقط تضميد الإبهام الفولاذ المقاوم للصدأ ، مسننة ، ضعيفة ؛ موردين متعددين ستائر منشفة معقمة دايناركس 4410 18 × 26 بوصة ، لتغطية وسادة التدفئة وتوفير مساحة عمل معقمة أثناء الجراحة