문맥 주사: 간으로의 암 전이를 연구하는 방법

Abstract

출처: Goddard, E. T., et al. 유방암의 간 전이를 연구하기 위한 문맥 주입 모델. J. Vis. 특급 (2016).

이 비디오는 문맥 주사를 통해 유방 종양 세포를 쥐 간에 전달하는 수술 절차를 설명합니다. 이 모델을 사용하면 간 전이의 후기 단계를 조사할 수 있습니다.

Protocol

1. 수술 부위 및 기구 준비

1. 계획된 수술 1-2일 전에 124°C에서 30분 동안 고압증기멸균하여 가위, 겸자 및 지혈을 준비합니다. 수술 후 회복을 위해 오토클레이브 또는 멸균 침구, 케이지 및 음식에 대한 접근을 보장합니다.
2. 무균 수술 부위를 준비하며, 가급적이면 층류 후드에 준비합니다.
   1. 발열 패드, 광원, 마취 튜브, 노즈 콘 및 수술 중 수술 절차와 가까운 곳에 있는 수술 부위의 기타 부분을 포함하여 10% 표백제로 수술 부위의 모든 표면을 닦습니다.
   2. 무균 수술 부위에 멸균 드레이프, 광원, 마취 튜브 및 노즈콘, 인슐린 주사기, 1ml 주사기, 부피바카인, 인공 눈물, 멸균 식염수, 2 x 2" 멸균 거즈 스폰지, 4 x 4" 멸균 거즈, 0.5 - 1cm2 조각으로 자른 지혈 거즈, 가위, 집게, 지혈, 테이퍼 바늘이 있는 4-0 비크릴 봉합사, 및 50ml 2% 클로르헥시딘 글루코네이트를 고압증기멸균 용기에 담았습니다.
   3. 이 공간에 얼음에 보관된 준비된 종양 세포를 위한 공간이 있는지 확인하십시오.
   4. 수술 부위에 인접한 벤치에서 두 번째 발열 패드로 회복 부위를 준비하고 멸균 침구로 케이지를 청소합니다.
      메모: 이 영역에는 구슬 살균기와 같은 품목도 수용할 수 있습니다.

2. 문맥 주입

1. 계획된 주사 1시간 전에 8-15주 된 Balb/c 암컷 마우스를 100μl의 0.015mg/ml 부프레노르핀으로 피하 투여하여 통증 관리를 돕습니다.
   메모: 이 주입 프로토콜은 균주 변경을 위해 적절한 세포주를 사용하여 모든 연령의 암컷 또는 수컷 마우스의 모든 균주에 적용할 수 있습니다.
2. 선택한 세포주 또는 종양 이식에 대한 프로토콜에 따라 주입을 위해 종양 세포를 준비합니다. 투여 전에 모든 종양 세포주를 검사하여 쥐 병원체의 존재 여부를 확인하여 이러한 병원체가 동물 군체에 도입될 위험을 줄입니다.
   1. D2A1, D2.OR 및 4T1 종양 세포를 포함한 syngeneic Balb/c 종양 세포주의 경우, 주입 3일 전에 세포를 10cm 조직 배양 플레이트로 해동하여 다음 날 세포가 ~ 90 - 100% 포화도가 되도록 합니다.
   2. 종양 세포 해동 1일 후 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 한 번 세척하고 0.05% 트립신 2ml를 사용하여 37°C에서 5분 동안 융합 종양 세포를 트립신화합니다.완전 배지 8ml(DMEM 고포도당, 10% 소 태아 혈청, 2mM L-글루타민 및 1x 페니실린/스트렙토마이신)를 추가하고 10ml의 완전 배지가 있는 신선한 10cm 접시에 1:10 배양을 추가합니다.
   3. 주사 당일, 1x PBS로 세포를 한 번 세척하고 위에서 설명한 대로 트립신화합니다.
   4. 트립신화된 세포를 8ml의 완전 배지에 재현탁하고, 1,500 x g에서 5분 동안 회전한 후, 배지를 제거하고 5ml 1x PBS에 재현탁합니다.
   5. 생존력 평가를 위해 trypan blue exclusion을 사용하여 혈구계에서 세포를 계산합니다. 1x PBS에 주입하기 위해 세포를 미리 결정된 농도와 부피로 재현탁합니다.
      참고: 5 - 10 μl는 더 작은 주입량으로 간에 대한 불필요한 손상을 방지하므로 권장됩니다.
   6. 주사하는 동안 세포를 얼음 위에 두십시오. 주입이 완료된 후 세포 샘플을 실험실로 반환하고 생존력을 보장하기 위해 1일 동안 완전한 배지에 배양합니다.
3. 산소로 전달되는 2 - 2.5% 이소플루란(2-chloro-2-(difluoromethoxy)-1,1,1-trifluoro-ethane)으로 마우스를 마취시킵니다. 발열 패드를 사용하여 체온을 유지하십시오.발가락 꼬집음에 대한 반응을 평가하여 완전한 마취를 확인한 다음 2 - 2.5% 이소플루란으로 마취를 유지하십시오.
   메모: 동물의 호흡 속도를 모니터링하고 절차 전반에 걸쳐 그에 따라 이소플루란 유속을 조정하는 것이 중요합니다.
4. 수술 중 눈이 과도하게 건조해지는 것을 방지하기 위해 각 눈에 소량의 인공 눈물 또는 수의사 연고를 바르십시오.
5. 복부가 드러난 상태에서 등을 대고 누운 자세로 마우스를 놓습니다.
6. 설치류의 두 번째 갈비뼈 공간에서 4번째 서혜부 유방 젖꼭지까지 화학적 제모로 해당 부위를 닦아 설치류의 복부 왼쪽에 있는 털을 제거합니다. 제모제를 1-2분 동안 그대로 두었다가 거즈와 H2O로 완전히 제거합니다. 이 단계는 수많은 수술이 계획되어 있는 경우 시간을 절약하기 위해 1-2일 전에 수행할 수 있습니다.
7. 2 x 2" 멸균 거즈 스폰지(2% 클로르헥시딘에 적신 것) 하나를 사용하여 제모 부위에서 마우스를 닦습니다. 기구의 박테리아 오염을 최소화하기 위해 꼬리를 포함한 주변 전체를 살균합니다.
8. 제모 부위와 주변 부위를 알코올 준비 패드로 닦습니다.
9. 2% 클로르헥시딘 및 알코올 단계를 한 번 더 반복하고 마지막 클로르헥시딘으로 총 3번의 2% 클로르헥시딘과 2번의 알코올 준비 패드 세척으로 마무리합니다. 클로르헥시딘이 내부 장기에 묻지 않도록 화학 물질이 수술 부위 주위로 흘러내리지 않도록 마지막 클로르헥시딘 닦기를 수행합니다.
   메모: 다량의 클로르헥시딘과 알코올을 피부와 주변 털에 바르면 체온이 크게 떨어질 수 있습니다. 2.7-2.9 단계에서 과도한 볼륨으로 닦지 마십시오. 발열 패드로 체온을 유지하십시오.
10. 멸균 장갑과 멸균 칼날이 달린 멸균된 메스를 사용하여 마우스의 왼쪽에 있는 정중면과 시상면 사이의 피부를 갈비뼈 바로 아래에서 시작하여 네 번째 서혜부 유선 젖꼭지 평면 바로 위에서 끝납니다.
11. 오토클레이브 또는 비드 멸균 가위와 집게를 사용하여 복막을 1인치 정도 절개합니다. 유방 지방 패드를 자르지 말고 장, 간 또는 횡격막을 자르지 않도록 하십시오.
12. 절개가 이루어진 마우스의 왼쪽에 멸균 식리수에 적신 4 x 4" 거즈 패드를 놓아 내부 장기를 거즈에 놓고 주변 피부나 수술 부위에 닿지 않도록 합니다.
13. 마우스를 준비하는 동안 종양 세포가 가라앉을 수 있으므로 여러 번 위아래로 피펫팅하여 종양 세포를 준비합니다. 25μl의 탈착식 주사기와 종양 세포가 있는 32게이지 바늘을 준비합니다. 종양 세포가 바늘 끝에 있고 플런저가 주사하기에 적절한 부피가 될 때까지 주사기를 누릅니다. 기포 주입을 피하십시오.
14. 멸균 알코올 패드로 바늘 바깥쪽을 닦아 외부 종양 세포를 제거합니다. 바늘이 찔리지 않도록 주의하십시오.
15. 피부와 복막 내벽을 포함한 절개 부위의 정중부를 겸자로 잡고 멸균 면봉을 사용하여 대장과 소장을 조심스럽게 당겨 멸균 식염수에 적신 멸균 거즈 위에 올려 놓습니다. 문맥이 시각화될 때까지 대장과 소장을 당겨 빼냅니다.
16. 내부 장기를 식염수에 적신 거즈로 덮어 내부 수분과 무균 상태를 유지합니다.
17. 역시 멸균 장갑을 낀 조수가 식염수에 적신 거즈로 감싼 장을 멸균 면봉으로 부드럽게 잡아 문맥이 완전히 드러나도록 합니다. 또한 절개 부위의 정중쪽에서 조직을 옆으로 고정하기 위해 오토클레이브 지혈 또는 겸자를 사용해야 할 수도 있습니다.
18. 종양 세포가 장전된 바늘을 문맥 ~ 3 - 5 mm 아래로 간 아래 10 mm< 경사면이 위를 향하도록 정맥에 5° 각도로 삽입합니다. 종양 세포가 포함된 전체 볼륨을 천천히 주입합니다. 종양 세포가 정맥 밖으로 역류하는 것을 방지하기 위해 몇 초 동안 혈액이 바늘 머리를 통해 흐르도록 합니다. 주사 중 정맥에서 바늘의 움직임을 최소화합니다. 다시 말하지만, 바늘 찌르기를 피하도록주의하십시오 .
    메모: 문맥의 시각화는 확대 없이 수행되지만 원하는 경우 실체 현미경을 사용할 수 있습니다.
19. 바늘을 제거하는 동시에 멸균 면 팁 애플리케이터를 압력으로 정맥에 놓습니다. 보조자가 여전히 장을 옆으로 잡고 있는 상태에서 0.5 - 1cm2 지혈 거즈 한 조각을 정맥의 주사 부위에 놓습니다.
    메모: 프로토콜의 이 단계에 대해 지혈 분말도 시도했지만 주사 후 정맥 출혈을 막는 데 효과적이지 않았습니다.
20. 멸균 면 팁 어플리케이터의 압력으로 주사 부위에 지혈 거즈를 5분 동안 유지합니다.
21. 지혈 거즈를 조심스럽게 들어 올려 정맥의 폐쇄를 평가하고, 거즈가 주변 조직에 달라붙으면 소량의 멸균 식염수를 사용하여 거즈를 담그고 들어 올릴 수 있습니다.
22. 이때 출혈이 발생하면 추가로 5분 동안 압력을 가하면서 해당 부위에 지혈 거즈를 추가로 놓습니다. 혈류가 완전히 멈추면 마우스에서 거즈를 제거합니다.
    메모: 수술 중 출혈은 신중하게 평가해야 하며, 허용되는 총 출혈량에 도달하거나 초과하는 경우(연구자의 기관 검토 위원회에 대한 규제 표준 운영 절차에 따라) 심장 관류에 의한 마취 상태에서 마우스를 안락사시켜야 합니다.
23. 주사 부위가 손상되지 않은 것으로 간주되면 주사 부위를 통해 혈액이 나오지 않으면 내부 장기를 복강에 부드럽게 다시 놓습니다.
24. 복막 내벽을 봉합한 다음 단순, 연속 또는 단속 봉합 패턴을 사용하여 멸균 4-0 비크릴 봉합사와 테이퍼 바늘로 피부를 봉합합니다. 일반적으로 절개 부위를 봉합하려면 10-15번의 봉합이 필요합니다.
25. 인슐린 주사기를 사용하여 국소 통증 관리를 위해 절개 부위를 따라 부피바카인 100μl(5mg/ml)를 주사합니다. 수분 공급을 위해 26게이지 바늘이 있는 1ml 주사기를 사용하여 0.5ml의 멸균 식염수를 피하에 주입합니다. 수술은 15 - 25분 정도 소요됩니다.
26. 수술 내내 멸균 상태를 유지하려면 장갑을 낀 손을 포함하여 마우스와 접촉하는 모든 도구와 재료를 접촉하기 전에 적절하게 세척해야 합니다. 가능한 경우 멸균 재료와 장갑을 사용하거나 70% 에탄올 용액 또는 10% 표백제 용액을 최소한으로 사용하여 청소하십시오.
27. 한 번의 세션으로 여러 번의 수술이 계획된 경우, 새로운 멸균 드레이프, 인슐린 주사기, 1ml 주사기, 멸균 식염수, 2 x 2" 멸균 거즈 스폰지, 4 x 4" 멸균 거즈, 0.5 - 1 cm2 조각으로 자른 지혈 거즈, 테이퍼 바늘이 있는 4-0 비크릴 봉합사, 2% 클로르헥시딘으로 초기 수술 부위를 다시 만듭니다. 수술 사이에 가위, 집게 및 지혈을 구슬로 소독하고 재사용하기 전에 적절하게 식히십시오.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1ml 주사기(26게이지 바늘 포함	BD 주사기	309597	309597
알코올 준비 패드	피셔 사이언티픽	06-669-62	외과적 절개 전 복부 청소용
다목적 스폰지, 멸균	켄 달	8044	4" x 4", 수술 중 대장과 소장을 보호하고 수분을 유지하기 위해 멸균 식염수에 담근 사용
인공 눈물	럭비	370114	미네랄오일 15%, 백색 바셀린 83%; 수술 중 눈 보호에 사용
부프레노르핀 HCl, 0.3 mg/ml	제조 : Reckitt Benckiser	재질 보기 NDC-12496-0757-1	체중 0.05 - 0.1 mg/kg, 72시간 동안 매일 1 - 2회 사용, 피하 주사
부피바카인 HCl, 0.5%(5mg/ml)	Humira Inc.의 제조	증권 시세 표시기 - 04091163-01	0.5%, 수술 직후 1회, 절개 부위에 피하 주사 10μl에서 사용
Celox™ 빠른 지혈 거즈	Medtrade 제품 주식 회사	FG08839011	5mm² 조각으로 자르고 주사 후 압력으로 문맥에서 혈류를 멈추는 데 사용합니다.
클로르헥시딘, 2% 용액	수의사 1	AN-번호 1CHL008	주의하고 마우스의 점막이나 귀에 클로르헥시딘을 묻히지 마십시오.
코튼 팁 애플리케이터, 멸균	피셔 사이언티픽	23-400-114	6" 나무 샤프트 2개/봉투
DMEM, 고혈당	하이클론	SH30243.01	D2A1, D2.OR 및 4T1 유방 종양 세포주와 함께 사용하기 위한 세포 배양 배지 베이스
드라이 유리 비드 살균기			스테인레스 스틸 도구를 살균하기 위해 수술 사이에 사용,주의를 사용하고 매우 뜨거운; 여러 공급 업체
에탄올, 70% 용액			가연성 주의; 필요에 따라 수술 부위를 청소하는 데 사용하십시오. 여러 공급 업체
소 태아 세럼	하이클론	SH30071.03	D2A1, D2.OR, 4T1과 함께 사용하기 위한 세포 배양 배지 첨가제 Journal of Visualized Experiments www.jove.com Copyright © 2016 Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Unported License Page 2 of 3 mammary tumor cell lines, use at 10% in DMEM high glucose
거즈, 멸균	켄 달	2146	2" x 2", 외과적 절개 전 복부 세척을 위해 클로르헥시딘 2% 용액에 담근 사용
이소플루란	피라말	재질 보기 ndc-66794-017-25	2.5% 투여
이소플루란 기화기	베트핍	911103	주의하고 마취 가스를 기화시킵니다.
탈착식 바늘 주사기, 25μl, 모델 1702	해밀턴	7654-01	문맥 주사의 경우; 종양 세포가 장전된 바늘로 작업하는 동안 주의하고 바늘이 부착되어 있을 때 날카롭
메스 손잡이			스테인레스 스틸; 여러 공급 업체
메스 블레이드, #15			탄소강, 멸균, 크기 15; 여러 공급업체
스몰 허브 탈착식 바늘, 32게이지	해밀턴	7803-04	문맥 주입의 경우 길이 1인치, 포인트 스타일 4, 12° 각도, 33-34게이지 재사용 가능한 바늘도 사용할 수 있습니다. 종양 세포가 장전된 바늘로 작업하는 동안 주의하고 날카롭게 사용하십시오
멸균 식염수	피셔 사이언티픽	BP358-212	0.9% NaCl 용액; 대안적으로, 집에서 만들고 멸균 여과할 수 있습니다
수술용 장갑, 멸균			여러 공급업체
봉합사, 멸균	에티콘	J310H	4-0 27" 코팅된 비크릴 w/ 22 mm 1/2c 테이퍼 에탈로이 바늘; 주의, 날카로운 사용
탁상용 휴대용 마취 기계	베트핍	901801	마우스 마취를 위해 isoflurane 기화기와 함께 사용
엄지 드레싱 겸자			스테인레스 스틸, 톱니 모양, 무뎌진; 여러 공급 업체
수건 커튼, 멸균	다이너렉스	4410	18" x 26", 발열 패드를 덮고 수술 중 멸균 작업 공간을 제공합니다

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