Injection de veines portail: Une méthode pour étudier la métastase du cancer au foie

Overview

Cette vidéo décrit une procédure chirurgicale pour délivrer des cellules tumorales mammaires au foie murin par injection de veine portail. Ce modèle permet l’étude des stades avancés de la métastase hépatique.

Protocol

1. Préparation de la zone chirurgicale et des instruments

1. Préparer les ciseaux, les forceps et l’hémostat en autoclavant à 124 °C pendant 30 min, 1 à 2 jours avant les chirurgies prévues. Assurer l’accès à la literie autoclavée ou stérile, aux cages et à la nourriture pour la récupération post-chirurgicale.
2. Préparer une zone chirurgicale aseptique, de préférence dans une hotte d’écoulement laminaire.
   1. Essuyez toutes les surfaces de la zone chirurgicale avec 10% d’eau de Javel, y compris le coussin chauffant, source de lumière, tube d’anesthésie et cône avant, et toute autre partie de la suite chirurgicale qui sera à proximité de l’intervention chirurgicale pendant qu’il est effectué.
   2. Dans la zone chirurgicale aseptique, placez le coussin chauffant nettoyé avec drapé stérile, source de lumière, tube d’anesthésie et nez, seringues à insuline, seringues de 1 ml, bupivacaine, larmes artificielles, saline stérile, éponges de gaze stériles de 2 x 2 po, gaze stérile de 4 x 4 po, gaze hémostatique coupée en morceaux de 0,5 à 1 cm2, ciseaux, forceps, hémostat, sutures vicryles 4-0 à aiguille fuselée et 50 ml 2 % chlorhexidine gluconate dans un contenant autoclavé.
   3. Assurez-vous qu’il y a de la place dans cet espace pour les cellules tumorales préparées stockées sur la glace.
   4. Sur le banc adjacent à la zone chirurgicale, préparer la zone de récupération avec un deuxième coussin chauffant et nettoyer les cages avec une literie stérile.
      REMARQUE: Cette zone peut également abriter des articles tels qu’un stérilisateur de perles.

2. Injection de veines portail

1. Une heure avant les injections prévues, traiter les souris femelles Balb/c âgées de 8 à 15 semaines avec 100 μl de buprénorphine de 0,015 mg/ml, sous-cutanée, pour la gestion de la douleur.
   REMARQUE: Ce protocole d’injection peut être appliqué à n’importe quelle souche de souris femelle ou mâle à tout âge, en utilisant les lignées cellulaires appropriées pour les changements à la souche.
2. Préparer les cellules tumorales à l’injection en fonction des protocoles de la lignée cellulaire ou de l’explantation tumorale de choix. Testez toutes les lignées cellulaires tumorales avant l’administration pour la présence d’agents pathogènes murins afin de réduire le risque d’introduire de tels agents pathogènes dans la colonie animale.
   1. Pour les lignées syngénéiques de cellules tumorales Balb/c, y compris les cellules tumorales D2A1, D2.OR et 4T1, décongelez les cellules dans une plaque de culture tissulaire de 10 cm 3 jours avant l’injection, de sorte que les cellules du lendemain sont à ~ 90 - 100% confluency.
   2. 1 jour suivant les cellules tumorales décongeler les cellules une fois avec 1x phosphate tamponné saline (PBS) et trypsiniser les cellules tumorales confluent en utilisant 2 ml de trypsine 0,05% à 37 °C pendant 5 min. Ajouter 8 ml de média complet (glucose élevé DMEM, sérum bovin fœtal à 10 %, 2 mM de L-glutamine et 1x pénicilline/streptomycine) et passer 1:10 dans un plat frais de 10 cm avec 10 ml de médias complets.
   3. Le jour des injections, laver les cellules une fois avec 1x PBS et trypsinize comme décrit ci-dessus.
   4. Resuspendez les cellules trypsinisées dans 8 ml de supports complets, faites tourner pendant 5 min à 1 500 x g, retirez le média et résuspendez en 5 ml 1x PBS.
   5. Comptez les cellules sur un hémocytomètre en utilisant l’exclusion bleue trypan pour l’évaluation de la viabilité. Resuspendez les cellules pour injection en 1x PBS à une concentration et un volume prédéterminés.
      REMARQUE : 5 à 10 μl sont recommandés car de plus petits volumes d’injection empêchent des dommages inutiles au foie.
   6. Gardez les cellules sur la glace pendant toute la durée des injections. Après l’achèvement des injections, retourner un échantillon de cellules au laboratoire et les placer en culture dans un média complet pendant 1 jour pour assurer la viabilité.
3. Placer la souris sous anesthésie avec 2 à 2,5 % d’isoflurane (2-chloro-2-(difluoromethoxy)-1,1,1-trifluoro-éthane) livré en oxygène. Maintenez la température corporelle à l’aide de la plaque chauffant.  Assurer une anesthésie complète en évaluant une réaction à une pincée d’un ateil, puis maintenir l’anesthésie à 2 - 2,5% isoflurane.
   REMARQUE: Il est important de surveiller le taux de respiration des animaux et d’ajuster le débit isoflurane en conséquence tout au long de la procédure.
4. Placez une petite quantité de larmes artificielles ou d’onguent vétérinaire sur chaque œil pour éviter un séchage excessif des yeux pendant l’intervention chirurgicale.
5. Placez la souris dans une position supine, sur le dos avec l’abdomen exposé.
6. Retirer les cheveux sur le côté gauche ventral du rongeur de l’espace de la deuxième nervure jusqu’au mamelon de la glande mammaire 4e inguinal en essuyant la zone avec un depilatory chimique. Laisser reposer le depilatory pendant 1 à 2 min, puis retirer complètement avec de la gaze et du H2O. Cette étape peut être effectuée de 1 à 2 jours à l’avance pour gagner du temps si de nombreuses interventions chirurgicales sont prévues.
7. Prenez une éponge stérile de gaze de 2 x 2 po (trempée dans 2 % de chlorhexidine) et essuyez la souris sur le site de l’épilation. Stériliser toute la zone environnante, y compris la queue, afin de minimiser la contamination bactérienne des instruments.
8. Essuyez le site de l’épilation et des environs avec un tampon de préparation à l’alcool.
9. Répétez 2% de chlorhexidine et d’alcool étapes une fois de plus et terminer avec un chiffon de chlorhexidine finale vers le bas pour un total de trois 2% chlorhexidine et deux lavages pad de préparation à l’alcool. Essuyez la chlorhexidine finale de telle sorte que le produit chimique ne coule pas autour du site chirurgical pour éviter d’obtenir de la chlorhexidine sur les organes internes.
   REMARQUE: L’application de grandes quantités de chlorhexidine et d’alcool sur la peau et la fourrure environnante peut entraîner une baisse significative de la température corporelle. Ne pas essuyer avec un volume excessif pendant les étapes 2.7-2.9. Maintenez la température corporelle avec un coussin chauffant.
10. À l’aide de gants stériles et d’un scalpel stérilisé à la lame stérile, faites une seule incision d’un pouce dans la peau entre les plans médian et sagittal sur le côté gauche de la souris, en commençant juste en dessous des côtes et en terminant juste au-dessus du plan de la quatrième tét de glande mammaire inguinale.
11. À l’aide de ciseaux et de forceps autoclavés ou stérilisés, faire une incision similaire de 1 pouce dans le péritoine. Évitez de couper dans la garniture de graisse mammaire et assurez-vous de ne pas couper les intestins, le foie ou le diaphragme.
12. Placez un tampon de gaze de 4 x 4 pouces trempé dans une solution saline stérile sur le côté gauche de la souris, où l’incision a été faite, de sorte que les organes internes peuvent être placés sur la gaze et ne pas entrer en contact avec la peau environnante ou la zone chirurgicale.
13. Préparez les cellules tumorales en pipetting de haut en bas plusieurs fois que les cellules tumorales se déposent pendant la préparation de la souris. Préparer une seringue d’aiguille amovible de 25 μl et une aiguille de calibre 32 avec des cellules tumorales. Poussez sur la seringue jusqu’à ce que les cellules tumorales soient à l’extrémité de l’aiguille et que le piston soit au volume approprié pour l’injection; éviter l’injection de bulles d’air.
14. Essuyer l’extérieur de l’aiguille avec un tampon d’alcool stérile pour enlever les cellules tumorales externes. Faire preuve de prudence pour éviter les piqûres d’aiguille.
15. Tenir le côté médian de l’incision, y compris la peau et la doublure péritonéale, de côté avec les forceps et utiliser un coton-tige stérile pour tirer soigneusement les gros intestins et les intestins grêles, les plaçant sur la gaze stérile trempée dans salin stérile. Retirez les gros intestins et les intestins grêles jusqu’à ce que la veine du portail soit visualisée.
16. Couvrir les organes internes dans la gaze saline trempée pour maintenir l’humidité interne et la stérilité.
17. Avoir un assistant, portant également des gants stériles, tenir les intestins enveloppés dans la gaze saline trempée doucement hors de la route avec un coton stérile à bout d’écouvillon pour révéler pleinement la veine portail. En outre, il peut être nécessaire d’utiliser l’hémostat autoclavé ou forceps pour tenir le tissu de côté sur le côté médian de l’incision.
18. Insérer l’aiguille chargée de cellules tumorales ~ 3 - 5 mm dans la veine portail ~ 10 mm au-dessous du foie à un angle < 5 ° à la veine, avec biseau face vers le haut. Injectez lentement le volume complet contenant des cellules tumorales. Laissez le sang couler au-delà de la tête de l’aiguille pendant plusieurs secondes pour éviter le flux arrière des cellules tumorales hors de la veine. Réduisez au minimum le déplacement de l’aiguille dans la veine pendant l’injection. Encore une fois, faire preuve de prudence pour éviter les piqûres d’aiguille.
    REMARQUE: La visualisation de la veine portail se fait sans grossissement, mais un microscope stéréo peut être utilisé si vous préférez.
19. Retirez l’aiguille tout en plaçant simultanément un applicateur stérile d’extrémité de coton sur la veine avec la pression. Avec l’assistant tenant encore les intestins de côté placer un morceau de 0,5 - 1 cm2 gaze hémostatique sur le site d’injection sur la veine.
    REMARQUE: La poudre hémostatique a également été essayée pour cette étape dans le protocole mais n’était pas efficace en arrêtant la perte veineuse de sang après injection.
20. Maintenez la gaze hémostatique au site d’injection sous la pression d’un applicateur stérile de pointe de coton pendant 5 min.
21. Évaluer la fermeture de la veine en soulevant soigneusement la gaze hémostatique, si la gaze colle au tissu environnant, une petite quantité de solution saline stérile peut être utilisée pour tremper et soulever la gaze.
22. Si la perte de sang se produit en ce moment, placez un morceau supplémentaire de gaze hémostatique sur le site avec la pression pendant 5 min supplémentaires. Lorsque le flux sanguin a complètement cessé, retirez la gaze de la souris.
    REMARQUE: La perte de sang pendant l’intervention chirurgicale doit être soigneusement évaluée et si le volume total autorisé de perte de sang est atteint ou dépassé (selon les procédures d’exploitation normalisées réglementaires pour les commissions d’examen institutionnelles de l’investigateur), la souris doit être euthanasiée pendant l’anesthésie par perfusion cardiaque.
23. Une fois que le site d’injection est jugé intact, sans que le sang ne quitte le site d’injection, placez doucement les organes internes dans la cavité abdominale.
24. Suture de la doublure péritonéale, puis la peau avec suture stérile 4-0 vicryl et aiguille conique en utilisant un simple motif de suture continue ou interrompue. Typiquement, la fermeture de l’incision nécessite 10-15 sutures.
25. Injecter 100 μl de bupivacaine (5 mg/ml) le long du site d’incision pour la gestion locale de la douleur à l’aide d’une seringue à insuline. Injecter 0,5 ml de solution saline stérile sous-cutanée à l’aide d’une seringue de 1 ml avec une aiguille de calibre 26 pour l’hydratation. Les chirurgies prennent de 15 à 25 min.
26. Pour maintenir des conditions stériles tout au long de la chirurgie, assurez-vous que tous les outils et matériaux en contact avec la souris, y compris les mains gantées, sont nettoyés de façon appropriée avant le contact. Dans la mesure du possible, utilisez des matériaux stériles et des gants, ou utilisez minimalement une solution d’éthanol à 70 % ou une solution d’eau de Javel à 10 % pour nettoyer.
27. Si plusieurs interventions chirurgicales sont prévues pour une seule séance refaire la zone chirurgicale initiale avec drapé stérile frais, seringues à insuline, 1 ml de seringues, saline stérile, éponges de gaze stériles de 2 x 2 po, gaze stérile de 4 x 4 po, gaze hémostatique coupée en morceaux de 0,5 à 1 cm2, sutures vicryles 4-0 à aiguille fuselée et 2 % chlorhexidine. Stériliser les ciseaux, les forceps et l’hémostat entre les chirurgies et laisser refroidir adéquatement avant de les réutiliser.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml Syringe w/ 26-gauge Needle	BD Syringe	309597	309597
Alcohol Prep Pads	Fisher Scientific	06-669-62	For cleaning of abdomen prior to surgical incision
All Purpose Sponges, Sterile	Kendall	8044	4" x 4", use dipped in sterile saline to keep large and small intestines protected and hydrated during surgery
Artificial Tears	Rugby	370114	Mineral oil 15%, white petrolatum 83%; use to protect eyes during surgery
Buprenorphine HCl, 0.3 mg/ml	Mfg. by Reckitt Benckiser	NDC-12496-0757-1	Use at 0.05 - 0.1 mg/kg body weight, 1 - 2x daily for 72 hr, injected subcutaneously
Bupivacaine HCl, 0.5% (5 mg/ml)	Mfg. by Humira Inc	NDC-04091163-01	Use at 0.5%, 1x immediately after surgery, 10 μl injected subcutaneously at incision site
Celox™ Rapid Hemostatic Gauze	Medtrade Products Ltd.	FG08839011	Cut into 5 mm² pieces, use to stop blood flow out of the portal vein with pressure following injection
Chlorhexidine, 2% Solution	Vet One	1CHL008	Use caution, do not get chlorhexidine in mucous membranes or ears of the mouse
Cotton Tipped Applicators, Sterile	Fisher Scientific	23-400-114	6" Wooden Shaft 2 pc/envelope
DMEM, High-Glucose	HyClone	SH30243.01	Cell culture media base for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines
Dry Glass Bead Sterilizer			Use between surgeries to sterilize stainless steel tools, use caution, extremely hot; multiple suppliers
Ethanol, 70% solution			Use caution flammable; use to clean surgical area as needed; multiple suppliers
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH30071.03	Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 Journal of Visualized Experiments www.jove.com Copyright © 2016 Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Unported License Page 2 of 3 mammary tumor cell lines, use at 10% in DMEM high glucose
Gauze, Sterile	Kendall	2146	2" x 2", use dipped in chlorhexidine 2% solution for cleaning of abdomen prior to surgical incision
Isoflurane	Piramal	NDC-66794-017-25	Administered at 2.5%
Isoflurane Vaporizer	VetEquip	911103	Use caution, vaporizes anesthetic gases
Removable Needle Syringe, 25 μl, Model 1702	Hamilton	7654-01	For portal vein injection; use caution, paricularly while working with tumor cell-loaded needles, sharp when needle is attached
Scalpel handle			Stainless steel; multiple suppliers
Scalpel blade, #15			Carbon steel, sterile, size 15; multiple suppliers
Small Hub Removable Needles, 32-gauge	Hamilton	7803-04	For portal vein injection, 1" length, point style 4, 12° angle, 33- to 34- gauge reusable needles can also be used; use caution, paricularly while working with tumor cell loaded needles, sharp
Sterile Saline	Fisher Scientific	BP358-212	0.9% NaCl solution; alternatively, can be homemade and sterile filtered
Surgical Gloves, Sterile			Multiple suppliers
Sutures, Sterile	Ethicon	J310H	4-0 27" coated vicryl w/ 22 mm 1/2c taper ethalloy needle; use caution, sharp
Table Top Portable Anesthesia Machine	VetEquip	901801	Use with isoflurane vaporizer for mouse anesthesia
Thumb Dressing Forceps			Stainless steel, serrated, blunted; multiple suppliers
Towel Drapes, Sterile	Dynarex	4410	18" x 26", to cover heating pad and provide a sterile workspace during surgery