Inyección de venas portal: un método para estudiar la metástasis del cáncer en el hígado

Overview

Este video describe un procedimiento quirúrgico para suministrar células tumorales mamarias al hígado murino a través de la inyección de venas portal. Este modelo permite la investigación de etapas tardías de metástasis hepática.

Protocol

1. Preparación del Área Quirúrgica e Instrumentos

1. Prepare las tijeras, fórceps y hemostat mediante autoclave a 124 °C durante 30 minutos, 1 - 2 días antes de las cirugías planificadas. Garantice el acceso a ropa de cama autoclavada o estéril, jaulas y alimentos para la recuperación postquirúrgica.
2. Prepare un área quirúrgica aséptica, preferiblemente en una campana de flujo laminar.
   1. Limpie todas las superficies del área quirúrgica con un 10% de lejía, incluyendo la almohadilla de calefacción, fuente de luz, tubos de anestesia y cono nasal, y cualquier otra parte de la suite quirúrgica que estará cerca del procedimiento quirúrgico mientras se realiza.
   2. En el área quirúrgica aséptica, coloque la almohadilla de calentamiento limpia con cortina estéril, fuente de luz, tubos de anestesia y nosecone, jeringas de insulina, jeringas de 1 ml, bupivacaína, lágrimas artificiales, solución salina estéril, esponjas de gasa estériles de 2 x 2", gasa estéril de 4 x 4", gasa hemostatica cortada en trozos de 0,5 - 1 cm2, tijeras, fórceps, hemostat, suturas vicryl de 4-0 con aguja cónica y gluconato de clorhexidina de 50 ml 2% en un recipiente autoclavado.
   3. Asegúrese de que haya espacio en este espacio para las células tumorales preparadas almacenadas en hielo.
   4. En el banco adyacente al área quirúrgica, prepare el área de recuperación con una segunda almohadilla de calefacción y jaulas limpias con ropa de cama estéril.
      NOTA: Esta zona también puede albergar artículos como un esterilizador de cuentas.

2. Inyección de venas portal

1. Una hora antes de las inyecciones planificadas, tratar a los ratones hembra De Balb/c de 8 a 15 semanas con 100 μl de 0,015 mg/ml de buprenorfina, por vía subcutánea, para el control del dolor.
   NOTA: Este protocolo de inyección se puede aplicar a cualquier cepa de ratón hembra o macho a cualquier edad, utilizando las líneas celulares adecuadas para cambios en la cepa.
2. Preparar las células tumorales para la inyección en base a protocolos para la línea celular o la explanta tumoral de elección. Pruebe todas las líneas celulares tumorales antes de la administración para detectar la presencia de patógenos murinos para reducir el riesgo de introducir estos patógenos en la colonia animal.
   1. Para las líneas celulares tumorales singenémicas balb/c incluyendo células tumorales D2A1, D2.OR y 4T1, descongelar las células en una placa de cultivo de tejido de 10 cm 3 días antes de la inyección de tal manera que los días siguientes las células están en ~ 90 - 100% confluencia.
   2. 1 día después del deshielo de células tumorales, las células lavan las células una vez con solución salina tamponada de fosfato 1x (PBS) e intentan trippsinizar las células tumorales confluentes utilizando 2 ml de trippsina del 0,05% a 37 °C durante 5 minutos. Añadir 8 ml de medios completos (dmem alta glucosa, 10% suero bovino fetal, 2 mM L-glutamina, y 1x penicilina / estreptomicina) y el paso 1:10 en un plato fresco de 10 cm con 10 ml de medios completos.
   3. El día de las inyecciones, lave las células una vez con 1x PBS y pruebe como se describió anteriormente.
   4. Resuspend células trippsinizadas en 8 ml de medios completos, girar durante 5 minutos a 1.500 x g, eliminar el medio y resuspend en 5 ml 1x PBS.
   5. Cuente las células en un hemociclograma utilizando la exclusión azul trypan para la evaluación de viabilidad. Células resuspend para inyección en 1x PBS a una concentración y volumen predeterminados.
      NOTA: 5 - Se recomienda 10 μl, ya que los volúmenes de inyección más pequeños evitan daños innecesarios en el hígado.
   6. Mantenga las células en hielo durante la duración de las inyecciones. Después de completar las inyecciones, devuelva una muestra de células al laboratorio y colóquela en cultivo en medios completos durante 1 día para garantizar la viabilidad.
3. Coloque el ratón bajo anestesia con 2 - 2.5% isoflurano (2-cloro-2-(difluoromethoxy)-1,1,1-trifluoro-etano) entregado en oxígeno. Mantenga la temperatura corporal utilizando la almohadilla de calefacción.  Asegúrese de una anestesia completa evaluando para una reacción a un pellizco del dedo del pie, y luego mantenga la anestesia en 2 - 2.5% isoflurano.
   NOTA: Es importante controlar el caudal de los animales y ajustar el caudal isoflurano en consecuencia durante todo el procedimiento.
4. Coloque una pequeña cantidad de lágrimas artificiales o ungüento veterinario sobre cada ojo para evitar el secado excesivo de los ojos durante el procedimiento quirúrgico.
5. Coloque el ratón en una posición supina, sobre su espalda con el abdomen expuesto.
6. Retire el cabello en el lado izquierdo ventral del roedor del segundo espacio de las costillas hasta el 4º pezón inguinal de la glándula mamaria limpiando la zona con depilatorio químico. Deje que el depilatorio se siente durante 1 - 2 minutos y luego retire completamente con gasa y H2O. Este paso se puede hacer con 1 - 2 días de anticipación para ahorrar tiempo si se planean numerosas cirugías.
7. Tome una esponja de gasa estéril de 2 x 2" (empapada en un 2% de clorhexidina) y limpie el ratón en el sitio de la depilación. Esterilizar toda la zona circundante, incluida la cola, para minimizar la contaminación bacteriana de los instrumentos.
8. Limpie el sitio de depilación y los alrededores con una almohadilla de preparación para el alcohol.
9. Repita un 2% los pasos de clorhexidina y alcohol una vez más y termine con una limpieza final de clorhexidina para un total de tres 2% de clorhexidina y dos lavados de almohadilla de preparación de alcohol. Haga la toallita final de clorhexidina de tal forma que el producto químico no esté goteando alrededor del sitio quirúrgico para evitar contraer clorhexidina en órganos internos.
   NOTA: La aplicación de grandes cantidades de clorhexidina y alcohol en la piel y el pelaje circundante puede resultar en una disminución significativa de la temperatura corporal. No limpie con exceso de volumen durante los pasos 2.7-2.9. Mantenga la temperatura corporal con una almohadilla de calefacción.
10. Usando guantes estériles y un bisturí esterilizado con hoja estéril, hacer una sola incisión de 1 pulgada en la piel entre la mediana y los planos sagitales en el lado izquierdo del ratón, comenzando justo debajo de las costillas y terminando justo por encima del plano de la cuarta glándula mamaria inguinal teat.
11. Usando tijeras y fórceps autoclavadas o esterilizadas con cuentas, haz una incisión similar de 1 pulgada en el peritoneo. Evite cortar en la almohadilla de grasa mamaria y asegúrese de no cortar los intestinos, el hígado o el diafragma.
12. Coloque una almohadilla de gasa de 4 x 4" empapada en solución salina estéril en el lado izquierdo del ratón, donde se hizo la incisión, de modo que los órganos internos se puedan colocar en la gasa y no entren en contacto con la piel circundante o el área quirúrgica.
13. Prepare las células tumorales pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces a medida que las células tumorales se asienten durante la preparación del ratón. Prepare una jeringa extraíble de aguja de 25 μl y una aguja del calibre 32 con células tumorales. Empuje la jeringa hasta que las células tumorales estén en la punta de la aguja y el émbolo esté en el volumen adecuado para la inyección; evitar la inyección de burbujas de aire.
14. Limpie el exterior de la aguja con una almohadilla de alcohol estéril para eliminar las células tumorales externas. Tenga cuidado para evitar los palos de aguja.
15. Sostenga el lado medio de la incisión, incluyendo la piel y el revestimiento peritoneal, a un lado con los fórceps y use un hisopo de algodón estéril para sacar cuidadosamente los intestinos grandes y delgados, colocándolos en la gasa estéril empapada en solución salina estéril. Extraiga los intestinos gruesos y pequeños hasta que se visualice la vena del portal.
16. Cubra los órganos internos de la gasa empapada salina para mantener la humedad interna y la esterilidad.
17. Pida a un asistente, que también use guantes estériles, sostenga los intestinos envueltos en la gasa empapada salina suavemente fuera del camino con un hisopo estéril con punta de algodón para revelar completamente la vena del portal. Además, puede ser necesario utilizar el hemostat autoclavado o fórceps para mantener el tejido a un lado en el lado medio de la incisión.
18. Inserte la aguja cargada con células tumorales ~ 3 - 5 mm en la vena del portal ~ 10 mm por debajo del hígado en un ángulo < 5° a la vena, con bisel hacia arriba. Inyecte lentamente el volumen completo que contiene las células tumorales. Deje que la sangre fluya más allá de la cabeza de la aguja durante varios segundos para evitar el flujo posterior de células tumorales fuera de la vena. Minimice el movimiento de la aguja en la vena durante la inyección. Una vez más, tenga cuidado de evitar los palos de aguja.
    NOTA: La visualización de la vena del portal se realiza sin aumento, sin embargo, se puede utilizar un microscopio estéreo si se prefiere.
19. Retire la aguja mientras coloca simultáneamente un aplicador estéril de punta de algodón en la vena con presión. Con el asistente todavía sosteniendo los intestinos a un lado coloque una pieza de gasa hemostática de 0,5 - 1 cm2 sobre el lugar de inyección en la vena.
    NOTA: Polvo hemostático también se intentó para este paso en el protocolo, pero no fue eficaz en detener la pérdida de sangre venosa después de la inyección.
20. Sujete la gasa hemostática en el lugar de inyección con la presión de un aplicador estéril de punta de algodón durante 5 minutos.
21. Evaluar el cierre de la vena levantando cuidadosamente la gasa hemostática, si la gasa se adhiere al tejido circundante, se puede utilizar una pequeña cantidad de solución salina estéril para remojar y levantar la gasa.
22. Si la pérdida de sangre ocurre en este momento, coloque una pieza adicional de gasa hemostática en el sitio con presión durante 5 minutos adicionales. Cuando el flujo sanguíneo haya cesado por completo, retire la gasa del ratón.
    NOTA: La pérdida de sangre durante el procedimiento quirúrgico debe evaluarse cuidadosamente y si se cumple o supera el volumen total de pérdida de sangre permitido (basado en procedimientos operativos estándar reglamentarios para las juntas de revisión institucional del investigador), el ratón debe ser eutanasiado mientras está bajo anestesia por perfusión cardíaca.
23. Una vez que el lugar de inyección se considere intacto, sin que la sangre salga del lugar de la inyección, coloque los órganos internos suavemente de nuevo en la cavidad abdominal.
24. Sutura el forro peritoneal y luego la piel con sutura 4-0 vicryl estéril y aguja cónica utilizando un patrón de sutura simple continuo o interrumpido. Normalmente, cerrar la incisión requiere 10-15 suturas.
25. Inyecte 100 μl de bupivacaína (5 mg/ml) a lo largo del sitio de incisión para el manejo local del dolor utilizando una jeringa de insulina. Inyecte 0,5 ml de solución salina estéril por vía subcutánea utilizando una jeringa de 1 ml con aguja de calibre 26 para hidratación. Las cirugías tardan de 15 a 25 minutos en completarse.
26. Para mantener condiciones estériles durante toda la cirugía, asegúrese de que todas las herramientas y materiales que entran en contacto con el ratón, incluidas las manos con guantes, se limpien adecuadamente antes del contacto. Siempre que sea posible utilice materiales estériles y guantes, o utilice mínimamente una solución de etanol del 70% o una solución de lejía al 10% para limpiar.
27. Si se planean varias cirugías para una sola sesión, rehacer el área quirúrgica inicial con cortina estéril fresca, jeringas de insulina, jeringas de 1 ml, solución salina estéril, esponjas de gasa estériles de 2 x 2", gasa estéril de 4 x 4", gasa hemostática cortada en trozos de 0,5 - 1 cm2, suturas vicryl 4-0 con aguja cónica y 2% clorhexidina. Abalorios esterilizar las tijeras, fórceps y hemostat entre cirugías y permitir enfriar adecuadamente antes de su reutilización.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml Syringe w/ 26-gauge Needle	BD Syringe	309597	309597
Alcohol Prep Pads	Fisher Scientific	06-669-62	For cleaning of abdomen prior to surgical incision
All Purpose Sponges, Sterile	Kendall	8044	4" x 4", use dipped in sterile saline to keep large and small intestines protected and hydrated during surgery
Artificial Tears	Rugby	370114	Mineral oil 15%, white petrolatum 83%; use to protect eyes during surgery
Buprenorphine HCl, 0.3 mg/ml	Mfg. by Reckitt Benckiser	NDC-12496-0757-1	Use at 0.05 - 0.1 mg/kg body weight, 1 - 2x daily for 72 hr, injected subcutaneously
Bupivacaine HCl, 0.5% (5 mg/ml)	Mfg. by Humira Inc	NDC-04091163-01	Use at 0.5%, 1x immediately after surgery, 10 μl injected subcutaneously at incision site
Celox™ Rapid Hemostatic Gauze	Medtrade Products Ltd.	FG08839011	Cut into 5 mm² pieces, use to stop blood flow out of the portal vein with pressure following injection
Chlorhexidine, 2% Solution	Vet One	1CHL008	Use caution, do not get chlorhexidine in mucous membranes or ears of the mouse
Cotton Tipped Applicators, Sterile	Fisher Scientific	23-400-114	6" Wooden Shaft 2 pc/envelope
DMEM, High-Glucose	HyClone	SH30243.01	Cell culture media base for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines
Dry Glass Bead Sterilizer			Use between surgeries to sterilize stainless steel tools, use caution, extremely hot; multiple suppliers
Ethanol, 70% solution			Use caution flammable; use to clean surgical area as needed; multiple suppliers
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH30071.03	Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 Journal of Visualized Experiments www.jove.com Copyright © 2016 Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Unported License Page 2 of 3 mammary tumor cell lines, use at 10% in DMEM high glucose
Gauze, Sterile	Kendall	2146	2" x 2", use dipped in chlorhexidine 2% solution for cleaning of abdomen prior to surgical incision
Isoflurane	Piramal	NDC-66794-017-25	Administered at 2.5%
Isoflurane Vaporizer	VetEquip	911103	Use caution, vaporizes anesthetic gases
Removable Needle Syringe, 25 μl, Model 1702	Hamilton	7654-01	For portal vein injection; use caution, paricularly while working with tumor cell-loaded needles, sharp when needle is attached
Scalpel handle			Stainless steel; multiple suppliers
Scalpel blade, #15			Carbon steel, sterile, size 15; multiple suppliers
Small Hub Removable Needles, 32-gauge	Hamilton	7803-04	For portal vein injection, 1" length, point style 4, 12° angle, 33- to 34- gauge reusable needles can also be used; use caution, paricularly while working with tumor cell loaded needles, sharp
Sterile Saline	Fisher Scientific	BP358-212	0.9% NaCl solution; alternatively, can be homemade and sterile filtered
Surgical Gloves, Sterile			Multiple suppliers
Sutures, Sterile	Ethicon	J310H	4-0 27" coated vicryl w/ 22 mm 1/2c taper ethalloy needle; use caution, sharp
Table Top Portable Anesthesia Machine	VetEquip	901801	Use with isoflurane vaporizer for mouse anesthesia
Thumb Dressing Forceps			Stainless steel, serrated, blunted; multiple suppliers
Towel Drapes, Sterile	Dynarex	4410	18" x 26", to cover heating pad and provide a sterile workspace during surgery