Portal Vene Injektion: En metode til at studere kræft metastaser til leveren

Overview

Denne video beskriver en kirurgisk procedure for at levere bryst tumorceller til murin leveren via portal vene injektion. Denne model tillader undersøgelse af sene stadier af levermetastase.

Protocol

1. Forberedelse af det kirurgiske område og instrumenter

1. Forbered saks, pincet og hæmostat ved autoklavering ved 124 °C i 30 minutter, 1 - 2 dage før de planlagte operationer. Sørg for adgang til autoklaveret eller sterilt strøelse, bure og mad til post-kirurgisk genopretning.
2. Forbered et aseptisk kirurgisk område, helst i en laminar flow hætte.
   1. Tør ned alle overflader af det kirurgiske område med 10% blegemiddel, herunder varmepude, lyskilde, anæstesi slange og næse kegle, og enhver anden del af den kirurgiske suite, der vil være i nærheden af den kirurgiske procedure, mens det bliver udført.
   2. I det aseptiske kirurgiske område skal du placere den rensede varmepude med steril drapering, lyskilde, anæstesirør og næsekonge, insulinsprøjter, 1 ml sprøjter, bupivacaine, kunstige tårer, steril saltvand, 2 x 2 "steril gaze svampe, 4 x 4" steril gaze, hemostatic gaze skåret i 0,5 - 1 cm2 stykker, saks, pincet, hæmostat, 4-0 vicryl suturer med koniske nål, og 50 ml 2% Chlorhexidine gluconate i en autoklaveret beholder.
   3. Sørg for, at der er plads i dette rum til forberedte tumorceller gemt på is.
   4. På bænken ved siden af det kirurgiske område skal du forberede genopretningsområdet med en anden varmepude og rene bure med sterilt sengetøj.
      BEMÆRK: Dette område kan også huse elementer såsom en perle sterilisator.

2. Portal vene Injektion

1. En time før de planlagte injektioner, behandle Balb / c kvindelige mus i alderen 8 - 15 uger med 100 μl på 0,015 mg / ml buprenorphin, subkutan, for smertebehandling.
   BEMÆRK: Denne injektion protokol kan anvendes på enhver stamme af kvindelige eller mandlige mus i alle aldre, ved hjælp af de relevante cellelinjer for ændringer i stammen.
2. Forbered tumorceller til injektion baseret på protokoller for cellelinjen eller tumor explant valg. Test alle tumorcellelinjer forud for indgift for tilstedeværelsen af murinpatogener for at reducere risikoen for at indføre sådanne patogener i dyrekolonien.
   1. For syngeneic Balb / c tumor cellelinjer, herunder D2A1, D2.OR, og 4T1 tumorceller, tø celler i en 10 cm væv kultur plade 3 dage før injektion, således at den følgende dag celler er på ~ 90 - 100% sammenløb.
   2. 1 dag efter tumor celle optø vaske celler en gang med 1x fosfat buffered saltvand (PBS) og trypsinize de sammenflydende tumorceller ved hjælp af 2 ml 0,05% trypsin ved 37 °C i 5 min. Der tilsættes 8 ml komplet medie (DMEM høj glucose, 10% føtalt kvægserum, 2 mM L-glutamin og 1x penicillin/streptomycin) og passage 1:10 i en frisk 10 cm skål med 10 ml komplet medie.
   3. På dagen for injektionerne vaskes celler en gang med 1x PBS og trypsiniseres som beskrevet ovenfor.
   4. Resuspend trypsiniserede celler i 8 ml komplette medier, spin i 5 min ved 1.500 x g, fjern mediet og resuspend i 5 ml 1x PBS.
   5. Tæl celler på et hæmocytometer ved hjælp af trypan blå udelukkelse for levedygtighed vurdering. Resuspend celler til injektion i 1x PBS ved en forudbestemt koncentration og volumen.
      BEMÆRK: 5 - 10 μl anbefales, da mindre injektionsvolumener forhindrer unødvendig skade på leveren.
   6. Hold cellerne på is under injektionerne. Efter afslutningen af injektionerne returneres en prøve af celler til laboratoriet, og der anbringes en dyrkning i komplette medier i 1 dag for at sikre levedygtighed.
3. Placer musen under anæstesi med 2 - 2,5% isofluran (2-chloro-2-(difluoromethoxy)-1,1,1-trifluoro-ethan) leveret i ilt. Hold kropstemperaturen ved hjælp af varmepuden.  Sørg for fuldstændig anæstesi ved at vurdere for en reaktion på en tå knivspids, og derefter opretholde anæstesi ved 2 - 2,5% isoflurane.
   BEMÆRK: Det er vigtigt at overvåge dyrenes vejrtrækningshastighed og justere isoflurane flowhastigheden i overensstemmelse hermed under hele proceduren.
4. Placer en lille mængde kunstige tårer eller dyrlæge salve over hvert øje for at undgå overdreven tørring af øjnene under den kirurgiske procedure.
5. Placer musen i en liggende position, på ryggen med maven udsat.
6. Fjern hår på gnaverens ventrale venstre side fra det andet ribbensrum ned til den 4. inguinal brystkirtel brystvorte ved at tørre området med kemisk depilatory. Lad depilatoriet sidde i 1 - 2 minutter og fjern derefter helt med gaze og H2O. Dette trin kan gøres 1 - 2 dage i forvejen for at spare tid, hvis der planlægges adskillige operationer.
7. Tag en 2 x 2 "steril gaze svamp (gennemblødt i 2% Chlorhexidine) og tørre musen på det sted, hårfjerning. Steriliser hele det omkringliggende område, herunder halen, for at minimere bakteriel forurening af instrumenter.
8. Tør stedet for hårfjerning og det omkringliggende område ned med en alkohol prep pad.
9. Gentag 2% Chlorhexidine og alkohol trin igen og af med en endelig Chlorhexidine tørre ned for i alt tre 2% Chlorhexidine og to alkohol prep pad vasker. Gør den endelige Chlorhexidine tørre sådan, at kemikaliet ikke drypper rundt på det kirurgiske sted for at undgå at få Chlorhexidine på indre organer.
   BEMÆRK: Anvendelse af store mængder klorhexidin og alkohol på huden og den omgivende pels kan resultere i et betydeligt fald i kropstemperaturen. Tør ikke med overskydende volumen under trin 2.7-2.9. Hold kropstemperaturen med en varmepude.
10. Brug sterile handsker og en steriliseret skalpel med sterilt blad, lav et enkelt 1-tommer snit i huden mellem median- og sagittalplanerne på venstre side af musen, der starter lige under ribbenene og slutter lige over flyet af den fjerde inguinal brystkirtelt.
11. Brug autoklaveret eller perle steriliseret saks og pincet, gøre en lignende 1-tommer snit i bughinden. Undgå at skære i bryst fedtpuden og sørg for ikke at skære tarmene, leveren eller mellemgulvet.
12. Placer en 4 x 4 "gaze pad gennemblødt i steril saltvand på venstre side af musen, hvor snittet blev foretaget, således at indre organer kan placeres på gaze og ikke komme i kontakt med den omgivende hud eller kirurgisk område.
13. Forbered tumorceller ved pipetter op og ned flere gange som tumorceller vil bosætte sig under forberedelsen af musen. Forbered en 25 μl aftagelig nålesprøjte og 32-gauge nål med tumorceller. Skub på sprøjten, indtil tumorcellerne er på spidsen af nålen, og stemplet er på det rette volumen til injektion; undgå indsprøjtning af luftbobler.
14. Tør ydersiden af nålen med en steril alkohol pad for at fjerne eventuelle eksterne tumorceller. Vær forsigtig for at undgå nålepinde.
15. Hold mediansiden af snittet, herunder hud og peritoneal foring, bortset fra pincet og brug en steril bomuldspinne til forsigtigt at trække de store og tyndtarmen ud og placere dem på den sterile gaze gennemblødt i steril saltvand. Træk store og tyndtarmen ud, indtil portalåren er visualiseret.
16. Dæk de indre organer i saltvandet gennemblødt gaze for at opretholde intern fugt og sterilitet.
17. Har en assistent, også iført sterile handsker, holde tarmene indpakket i saltvand gennemblødt gaze forsigtigt ud af vejen med en steril bomuld tippet vatpind til fuldt ud at afsløre portalen vene. Derudover kan det være nødvendigt at bruge autoklaveret hæmostat eller pincet til at holde væv til side på mediansiden af snittet.
18. Sæt nålen fyldt med tumorceller ~ 3 - 5 mm ind i portalvenen ~ 10 mm under leveren i en vinkel < 5 ° til venen, med facet vendt op. Injicer langsomt det fulde volumen, der indeholder tumorceller. Lad blodet flyde forbi nålehovedet i flere sekunder for at undgå tilbagestrømning af tumorceller ud af venen. Minimer flytningen af nålen i venen under injektionen. Igen skal du være forsigtig for at undgå nålepinde.
    BEMÆRK: Visualisering af portalen vene sker uden forstørrelse, men et stereomikroskop kan bruges, hvis det foretrækkes.
19. Fjern nålen, mens du samtidig placerer en steril bomuldsspidsapplikator på venen med tryk. Med assistenten stadig holder tarmene til side placere et stykke af 0,5 - 1 cm2 hemostatic gaze over injektionsstedet på venen.
    BEMÆRK: Hemostatic pulver blev også forsøgt for dette trin i protokollen, men var ikke effektiv til at stoppe venøs blodtab efter injektion.
20. Hold hemostatic gaze på injektionsstedet med tryk fra en steril bomuld spids applikator i 5 min.
21. Vurder lukningen af venen ved omhyggeligt at løfte hemostatic gaze, hvis gaze klæber til det omgivende væv, en lille mængde steril saltvand kan bruges til at suge og løfte gaze.
22. Hvis der opstår blodtab på dette tidspunkt, skal du placere et ekstra stykke hemostatisk gasbind på stedet med tryk i yderligere 5 minutter. Når blodgennemstrømningen er ophørt helt, skal du fjerne gaze fra musen.
    BEMÆRK: Blodtab under den kirurgiske procedure skal nøje vurderes, og hvis det samlede tilladte blodtab volumen er opfyldt eller overskredet (baseret på lovgivningsmæssige standard driftsprocedurer for investigator's institutionelle review boards) musen skal aflives, mens under bedøvelse ved hjerte-perfusion.
23. Når injektionsstedet anses for intakt, uden at blodet forlader injektionsstedet, skal du placere de indre organer forsigtigt tilbage i bughulen.
24. Sutur peritoneal foring og derefter huden med sterile 4-0 vicryl sutur og koniske nål ved hjælp af en simpel kontinuerlig eller afbrudt sutur mønster. Typisk kræver lukning af snittet 10-15 suturer.
25. Der injiceres 100 μl bupivacain (5 mg/ml) langs indsnitsstedet til lokal smertebehandling ved hjælp af en insulinsprøjte. Der injiceres 0,5 ml steril saltvand underkutant ved hjælp af en 1 ml sprøjte med 26-gauge nål til hydrering. Operationer tager 15 - 25 minutter at gennemføre.
26. For at opretholde sterile forhold under hele operationen skal du sikre dig, at alt værktøj og materialer, der kommer i kontakt med musen, herunder behandskede hænder, rengøres korrekt inden kontakt. Brug så vidt muligt sterile materialer og handsker, eller brug minimalt en 70% ethanolopløsning eller 10% blegemiddelopløsning til rengøring.
27. Hvis flere operationer er planlagt til en enkelt session remake den oprindelige kirurgiske område med friske sterile drapere, insulin sprøjter, 1 ml sprøjter, steril saltvand, 2 x 2 "steril gaze svampe, 4 x 4" steril gaze, hemostatic gaze skåret i 0,5 - 1 cm2 stykker, 4-0 vicryl suturer med koniske nål, og 2% Chlorhexidine. Perle-sterilisere saks, pincet, og hæmostat i mellem operationer og give mulighed for at tilstrækkeligt afkøle før genbrug.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml Syringe w/ 26-gauge Needle	BD Syringe	309597	309597
Alcohol Prep Pads	Fisher Scientific	06-669-62	For cleaning of abdomen prior to surgical incision
All Purpose Sponges, Sterile	Kendall	8044	4" x 4", use dipped in sterile saline to keep large and small intestines protected and hydrated during surgery
Artificial Tears	Rugby	370114	Mineral oil 15%, white petrolatum 83%; use to protect eyes during surgery
Buprenorphine HCl, 0.3 mg/ml	Mfg. by Reckitt Benckiser	NDC-12496-0757-1	Use at 0.05 - 0.1 mg/kg body weight, 1 - 2x daily for 72 hr, injected subcutaneously
Bupivacaine HCl, 0.5% (5 mg/ml)	Mfg. by Humira Inc	NDC-04091163-01	Use at 0.5%, 1x immediately after surgery, 10 μl injected subcutaneously at incision site
Celox™ Rapid Hemostatic Gauze	Medtrade Products Ltd.	FG08839011	Cut into 5 mm² pieces, use to stop blood flow out of the portal vein with pressure following injection
Chlorhexidine, 2% Solution	Vet One	1CHL008	Use caution, do not get chlorhexidine in mucous membranes or ears of the mouse
Cotton Tipped Applicators, Sterile	Fisher Scientific	23-400-114	6" Wooden Shaft 2 pc/envelope
DMEM, High-Glucose	HyClone	SH30243.01	Cell culture media base for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines
Dry Glass Bead Sterilizer			Use between surgeries to sterilize stainless steel tools, use caution, extremely hot; multiple suppliers
Ethanol, 70% solution			Use caution flammable; use to clean surgical area as needed; multiple suppliers
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH30071.03	Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 Journal of Visualized Experiments www.jove.com Copyright © 2016 Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Unported License Page 2 of 3 mammary tumor cell lines, use at 10% in DMEM high glucose
Gauze, Sterile	Kendall	2146	2" x 2", use dipped in chlorhexidine 2% solution for cleaning of abdomen prior to surgical incision
Isoflurane	Piramal	NDC-66794-017-25	Administered at 2.5%
Isoflurane Vaporizer	VetEquip	911103	Use caution, vaporizes anesthetic gases
Removable Needle Syringe, 25 μl, Model 1702	Hamilton	7654-01	For portal vein injection; use caution, paricularly while working with tumor cell-loaded needles, sharp when needle is attached
Scalpel handle			Stainless steel; multiple suppliers
Scalpel blade, #15			Carbon steel, sterile, size 15; multiple suppliers
Small Hub Removable Needles, 32-gauge	Hamilton	7803-04	For portal vein injection, 1" length, point style 4, 12° angle, 33- to 34- gauge reusable needles can also be used; use caution, paricularly while working with tumor cell loaded needles, sharp
Sterile Saline	Fisher Scientific	BP358-212	0.9% NaCl solution; alternatively, can be homemade and sterile filtered
Surgical Gloves, Sterile			Multiple suppliers
Sutures, Sterile	Ethicon	J310H	4-0 27" coated vicryl w/ 22 mm 1/2c taper ethalloy needle; use caution, sharp
Table Top Portable Anesthesia Machine	VetEquip	901801	Use with isoflurane vaporizer for mouse anesthesia
Thumb Dressing Forceps			Stainless steel, serrated, blunted; multiple suppliers
Towel Drapes, Sterile	Dynarex	4410	18" x 26", to cover heating pad and provide a sterile workspace during surgery