Portal aderinjectie: een methode om kankermetastasen naar de lever te bestuderen

Overview

Deze video beschrijft een chirurgische procedure om borsttumorcellen via poortaderinjectie aan de muriene lever te leveren. Dit model maakt het mogelijk om late stadia van levermetastasen te onderzoeken.

Protocol

1. Voorbereiding van het operatiegebied en de instrumenten

1. Bereid de schaar, tang en hemostase voor door 30 min, 1 - 2 dagen voorafgaand aan de geplande operaties bij 124 °C te autoclaafen. Zorg voor toegang tot autoclaaf of steriel beddengoed, kooien en voedsel voor postoperatief herstel.
2. Bereid een aseptisch chirurgisch gebied voor, bij voorkeur in een laminaire stromingskap.
   1. Veeg alle oppervlakken van het chirurgische gebied af met 10% bleekmiddel, inclusief het verwarmingskussen, de lichtbron, de anesthesieslang en de neuskegel, en elk ander deel van de chirurgische suite dat zich in de nabijheid van de chirurgische procedure bevindt terwijl het wordt uitgevoerd.
   2. Plaats in het aseptische chirurgische gebied het gereinigde verwarmingskussen met steriel laken, lichtbron, anesthesieslang en nosecone, insulinespuiten, 1 ml spuiten, bupivacaïne, kunsttranen, steriele zoutoplossing, 2 x 2" steriele gaassponzen, 4 x 4" steriel gaas, hemostatisch gaas gesneden in 0,5 - 1 cm2 stuks, schaar, tang, hemostase, 4-0 vicryl.
   3. Zorg ervoor dat er in deze ruimte ruimte is voor voorbereide tumorcellen die op ijs zijn opgeslagen.
   4. Bereid op de bank naast het operatiegebied het herstelgebied voor met een tweede verwarmingskussen en schone kooien met steriel beddengoed.
      OPMERKING: Dit gebied kan ook items huisvesten, zoals een kralensterilisator.

2. Portal ader injectie

1. Behandel Balb/c vrouwelijke muizen van 8 - 15 weken een uur voor de geplande injecties met 100 μl buprenorfine van 0,015 mg/ml, subcutaan, voor pijnbestrijding.
   OPMERKING: Dit injectieprotocol kan worden toegepast op elke stam van vrouwelijke of mannelijke muis op elke leeftijd, met behulp van de juiste cellijnen voor veranderingen in de stam.
2. Bereid de tumorcellen voor op injectie op basis van protocollen voor de cellijn of tumor explant naar keuze. Test alle tumorcellijnen vóór toediening op de aanwezigheid van muriene pathogenen om het risico op het binnenbrengen van dergelijke pathogenen in de dierenkolonie te verminderen.
   1. Voor syngeneïsche Balb/c tumorcellijnen, waaronder D2A1, D2.OR en 4T1 tumorcellen, ontdooien cellen in een weefselkweekplaat van 10 cm 3 dagen voor injectie, zodat de volgende dag cellen ~ 90 - 100% samenvloeiing hebben.
   2. 1 dag na het ontdooien van tumorcellen was de cellen eenmaal met 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en trypsineer de samenvloeiende tumorcellen met 2 ml 0,05% trypsine bij 37 °C gedurende 5 min. Voeg 8 ml complete media (DMEM hoge glucose, 10% foetale runderserum, 2 mM L-glutamine en 1x penicilline/streptomycine) en passage 1:10 in een verse schaal van 10 cm met 10 ml complete media.
   3. Was op de dag van de injecties de cellen eenmaal met 1x PBS en probeer ze zoals hierboven beschreven.
   4. Resuspend trypsinized cellen in 8 ml complete media, draai gedurende 5 minuten op 1.500 x g, verwijder de media en resuspend in 5 ml 1x PBS.
   5. Tel cellen op een hemocytometer met behulp van trypan blauwe uitsluiting voor de beoordeling van de levensvatbaarheid. Resuspend cellen voor injectie in 1x PBS bij een vooraf bepaalde concentratie en volume.
      OPMERKING: 5 - 10 μl wordt aanbevolen omdat kleinere injectievolumes onnodige schade aan de lever voorkomen.
   6. Houd cellen op ijs voor de duur van de injecties. Breng na voltooiing van de injecties een monster van cellen terug naar het laboratorium en plaats het gedurende 1 dag in volledige media in volledige media om de levensvatbaarheid te garanderen.
3. Plaats de muis onder narcose met 2 - 2,5% isofluraan (2-chloro-2-(difluormethodoxy)-1,1,1-trifluor-ethaan) geleverd in zuurstof. Houd de lichaamstemperatuur aan met behulp van het verwarmingskussen.  Zorg voor volledige anesthesie door te beoordelen op een reactie op een teenknijp en handhaaf vervolgens de anesthesie op 2 - 2,5% isofluraan.
   OPMERKING: Het is belangrijk om de ademhalingsfrequentie van de dieren te controleren en het isofluraandebiet gedurende de hele procedure dienovereenkomstig aan te passen.
4. Plaats een kleine hoeveelheid kunsttranen of dierenartszalf over elk oog om overmatig drogen van de ogen tijdens de chirurgische procedure te voorkomen.
5. Plaats de muis in een liggende positie, op zijn rug met blootgestelde buik.
6. Verwijder het haar aan de ventrale linkerkant van het knaagdier van de tweede ribruimte tot aan de 4e inguinale borstkliernippel door het gebied af te vegen met chemisch ontharingskanaal. Laat het ontharingsbevel 1 - 2 minuten zitten en verwijder het vervolgens volledig met gaas en H2O. Deze stap kan 1 - 2 dagen van tevoren worden uitgevoerd om tijd te besparen als er tal van operaties zijn gepland.
7. Neem een steriele gaasspons van 2 x 2" (gedrenkt in 2% chloorhexidine) en veeg de muis af op de plaats van ontharing. Steriliseer de hele omgeving, inclusief de staart, om bacteriële besmetting van instrumenten te minimaliseren.
8. Veeg de plaats van ontharing en omgeving naar beneden met een alcohol prep pad.
9. Herhaal 2% chloorhexidine en alcohol stappen nogmaals en eindig met een laatste chloorhexidine veeg naar beneden voor een totaal van drie 2% chloorhexidine en twee alcohol prep pad wasbeurten. Doe het laatste chloorhexidinedoekje zodanig dat de chemische stof niet rond de chirurgische plaats druppelt om te voorkomen dat chloorhexidine op interne organen wordt gekregen.
   OPMERKING: Toepassing van grote hoeveelheden chloorhexidine en alcohol op de huid en de omliggende vacht kan leiden tot een aanzienlijke daling van de lichaamstemperatuur. Veeg niet met overtollig volume tijdens stap 2.7-2.9. Houd de lichaamstemperatuur op peil met een verwarmingskussen.
10. Maak met steriele handschoenen en een gesteriliseerde scalpel met steriel mes een enkele incisie van 1 inch in de huid tussen de mediane en sagittale vlakken aan de linkerkant van de muis, beginnend net onder de ribben en eindigend net boven het vlak van de vierde inguinale borstklier speen.
11. Met behulp van autoclaaf of kraal gesteriliseerde schaar en tang, maak een soortgelijke 1-inch incisie in het buikvlies. Vermijd snijden in het borstvetkussen en zorg ervoor dat u de darmen, lever of middenrif niet snijdt.
12. Plaats een gaasje van 4 x 4" gedrenkt in steriele zoutoplossing aan de linkerkant van de muis, waar de incisie is gemaakt, zodat inwendige organen op het gaas kunnen worden geplaatst en niet in contact kunnen komen met de omringende huid of het chirurgische gebied.
13. Bereid tumorcellen voor door meerdere keren op en neer te gaan, omdat tumorcellen zich zullen vestigen tijdens de voorbereiding van de muis. Bereid een verwijderbare naaldspuit van 25 μl en een naald met 32 gauge met tumorcellen voor. Druk op de spuit totdat de tumorcellen zich op de punt van de naald bevinden en de zuiger op het juiste volume is voor injectie; vermijd injectie van luchtbellen.
14. Veeg de buitenkant van de naald af met een steriel alcoholkussen om eventuele externe tumorcellen te verwijderen. Wees voorzichtig om naaldprikken te voorkomen.
15. Houd de mediane kant van de incisie, inclusief huid en peritoneale voering, opzij met de tang en gebruik een steriel wattenstaafje om de grote en dunne darmen voorzichtig eruit te trekken en plaats ze op het steriele gaas gedrenkt in steriele zoutoplossing. Trek grote en dunne darmen eruit totdat de poortader wordt gevisualiseerd.
16. Bedek de inwendige organen in het met zoutoplossing doordrenkte gaas om intern vocht en steriliteit te behouden.
17. Laat een assistent, die ook steriele handschoenen draagt, de darmen gewikkeld in het met zoutoplossing doordrenkte gaas voorzichtig uit de weg houden met een steriel wattenstaafje om de poortader volledig te onthullen. Bovendien kan het nodig zijn om de autoclaafhemostase of tang te gebruiken om weefsel opzij te houden aan de mediane kant van de incisie.
18. Steek de naald geladen met tumorcellen ~ 3 - 5 mm in de poortader ~ 10 mm onder de lever onder een hoek < 5° ten opzichte van de ader, met schuine kant naar boven. Injecteer langzaam het volledige volume dat tumorcellen bevat. Laat het bloed enkele seconden langs de naaldkop stromen om terugstroming van tumorcellen uit de ader te voorkomen. Minimaliseer het bewegen van de naald in de ader tijdens de injectie. Nogmaals, wees voorzichtig om naaldprikken te voorkomen.
    OPMERKING: Visualisatie van de poortader gebeurt zonder vergroting, maar indien gewenst kan een stereomicroscoop worden gebruikt.
19. Verwijder de naald terwijl u tegelijkertijd een steriele katoenen tip applicator onder druk op de ader plaatst. Terwijl de assistent de darmen nog steeds opzij houdt, plaatst u een stuk van 0,5 - 1 cm2 hemostatisch gaas over de injectieplaats op de ader.
    OPMERKING: Hemostatisch poeder werd ook geprobeerd voor deze stap in het protocol, maar was niet effectief in het stoppen van veneus bloedverlies na injectie.
20. Houd het hemostatische gaas op de injectieplaats met druk van een steriele katoenen tip applicator gedurende 5 minuten vast.
21. Beoordeel de sluiting van de ader door het hemostatische gaas voorzichtig op te tillen, als het gaas aan het omliggende weefsel kleeft, kan een kleine hoeveelheid steriele zoutoplossing worden gebruikt om het gaas te weken en op te tillen.
22. Als er op dit moment bloedverlies optreedt, plaats dan een extra stuk hemostatisch gaas op de plaats met druk gedurende nog eens 5 minuten. Wanneer de bloedstroom volledig is gestopt, verwijdert u het gaas van de muis.
    OPMERKING: Bloedverlies tijdens de chirurgische ingreep moet zorgvuldig worden beoordeeld en als het totale toegestane bloedverliesvolume wordt voldaan of overschreden (op basis van wettelijke standaardprocedures voor de institutionele beoordelingscommissies van de onderzoeker), moet de muis worden geëuthanaseerd onder anesthesie door cardiale perfusie.
23. Zodra de injectieplaats intact wordt geacht, zonder dat er bloed de injectieplaats verlaat, plaatst u de inwendige organen voorzichtig terug in de buikholte.
24. Hecht de peritoneale voering en vervolgens de huid met steriele 4-0 vicryl hechtdraad en tapse naald met behulp van een eenvoudig continu of onderbroken hechtpatroon. Meestal vereist het sluiten van de incisie 10-15 hechtingen.
25. Injecteer 100 μl bupivacaïne (5 mg/ml) langs de incisieplaats voor lokale pijnbestrijding met behulp van een insulinespuit. Injecteer 0,5 ml steriele zoutoplossing subcutaan met een spuit van 1 ml met een naald van 26 gauge voor hydratatie. Operaties duren 15 - 25 minuten om te voltooien.
26. Om steriele omstandigheden tijdens de operatie te behouden, moet u ervoor zorgen dat alle gereedschappen en materialen die in contact komen met de muis, inclusief gehandschoende handen, op de juiste manier worden gereinigd voordat ze in contact komen. Gebruik waar mogelijk steriele materialen en handschoenen, of gebruik minimaal een 70% ethanoloplossing of 10% bleekoplossing om te reinigen.
27. Als meerdere operaties zijn gepland voor een enkele sessie, maak dan het eerste chirurgische gebied opnieuw met vers steriel laken, insulinespuiten, spuiten van 1 ml, steriele zoutoplossing, 2 x 2" steriele gaassponzen, 4 x 4" steriel gaas, hemostatisch gaas in 0,5 - 1 cm2 stukken gesneden, 4-0 vicryl hechtingen met spitse naald en 2% chloorhexidine. Steriliseer de schaar, tang en hemostase tussen de operaties door en laat voldoende afkoelen voor hergebruik.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml Syringe w/ 26-gauge Needle	BD Syringe	309597	309597
Alcohol Prep Pads	Fisher Scientific	06-669-62	For cleaning of abdomen prior to surgical incision
All Purpose Sponges, Sterile	Kendall	8044	4" x 4", use dipped in sterile saline to keep large and small intestines protected and hydrated during surgery
Artificial Tears	Rugby	370114	Mineral oil 15%, white petrolatum 83%; use to protect eyes during surgery
Buprenorphine HCl, 0.3 mg/ml	Mfg. by Reckitt Benckiser	NDC-12496-0757-1	Use at 0.05 - 0.1 mg/kg body weight, 1 - 2x daily for 72 hr, injected subcutaneously
Bupivacaine HCl, 0.5% (5 mg/ml)	Mfg. by Humira Inc	NDC-04091163-01	Use at 0.5%, 1x immediately after surgery, 10 μl injected subcutaneously at incision site
Celox™ Rapid Hemostatic Gauze	Medtrade Products Ltd.	FG08839011	Cut into 5 mm² pieces, use to stop blood flow out of the portal vein with pressure following injection
Chlorhexidine, 2% Solution	Vet One	1CHL008	Use caution, do not get chlorhexidine in mucous membranes or ears of the mouse
Cotton Tipped Applicators, Sterile	Fisher Scientific	23-400-114	6" Wooden Shaft 2 pc/envelope
DMEM, High-Glucose	HyClone	SH30243.01	Cell culture media base for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines
Dry Glass Bead Sterilizer			Use between surgeries to sterilize stainless steel tools, use caution, extremely hot; multiple suppliers
Ethanol, 70% solution			Use caution flammable; use to clean surgical area as needed; multiple suppliers
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH30071.03	Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 Journal of Visualized Experiments www.jove.com Copyright © 2016 Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Unported License Page 2 of 3 mammary tumor cell lines, use at 10% in DMEM high glucose
Gauze, Sterile	Kendall	2146	2" x 2", use dipped in chlorhexidine 2% solution for cleaning of abdomen prior to surgical incision
Isoflurane	Piramal	NDC-66794-017-25	Administered at 2.5%
Isoflurane Vaporizer	VetEquip	911103	Use caution, vaporizes anesthetic gases
Removable Needle Syringe, 25 μl, Model 1702	Hamilton	7654-01	For portal vein injection; use caution, paricularly while working with tumor cell-loaded needles, sharp when needle is attached
Scalpel handle			Stainless steel; multiple suppliers
Scalpel blade, #15			Carbon steel, sterile, size 15; multiple suppliers
Small Hub Removable Needles, 32-gauge	Hamilton	7803-04	For portal vein injection, 1" length, point style 4, 12° angle, 33- to 34- gauge reusable needles can also be used; use caution, paricularly while working with tumor cell loaded needles, sharp
Sterile Saline	Fisher Scientific	BP358-212	0.9% NaCl solution; alternatively, can be homemade and sterile filtered
Surgical Gloves, Sterile			Multiple suppliers
Sutures, Sterile	Ethicon	J310H	4-0 27" coated vicryl w/ 22 mm 1/2c taper ethalloy needle; use caution, sharp
Table Top Portable Anesthesia Machine	VetEquip	901801	Use with isoflurane vaporizer for mouse anesthesia
Thumb Dressing Forceps			Stainless steel, serrated, blunted; multiple suppliers
Towel Drapes, Sterile	Dynarex	4410	18" x 26", to cover heating pad and provide a sterile workspace during surgery