הזרקת וריד הפורטל: שיטה לחקר גרורות סרטן לכבד

Overview

וידאו זה מתאר הליך כירורגי כדי לספק תאים סרטניים mammary לכבד מורין באמצעות הזרקת וריד פורטל. מודל זה מאפשר חקירה של שלבים מאוחרים של גרורות בכבד.

Protocol

1. הכנת התחום הכירורגי והמכשירים

1. מכינים את המספריים, המלקחיים והמוסטט על ידי אוטוקלאבינג ב 124 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות, 1 - 2 ימים לפני הניתוחים המתוכננים. להבטיח גישה למצעים, כלובים ומזון אוטומטיים או סטריליים להתאוששות לאחר הניתוח.
2. הכינו אזור כירורגי אספטי, רצוי במכסה המנוע של זרימה למינארית.
   1. לנגב את כל המשטחים של האזור הכירורגי עם 10% אקונומיקה, כולל כרית החימום, מקור האור, צינורות הרדמה וחרוט האף, וכל חלק אחר של החבילה הכירורגית שיהיה בסמיכות להליך הכירורגי בזמן ביצועו.
   2. באזור הניתוחי אספטי, מניחים את כרית החימום המנוקה עם וילון סטרילי, מקור אור, צינורות הרדמה ואקון אף, מזרקי אינסולין, מזרקים 1 מ"ל, bupivacaine, דמעות מלאכותיות, מלוחים סטריליים, ספוגי גזה סטריליים בגודל 2 אינץ', גזה סטרילית בגודל 4x4 אינץ', גזה היסטטית חתוכה ל-0.5 - 1 מ"ר חתיכות, מספריים, מלקחיים, המוסטט, תפרים ויקרילים 4-0 עם מחט טפר, ו-50 מ"ל 2% כלורקסידין גלוקונט באוטוקל.
   3. ודא כי יש מקום בחלל זה עבור תאים סרטניים מוכנים המאוחסנים על קרח.
   4. על הספסל הסמוך לאזור הניתוח, הכינו את אזור ההחלמה עם כרית חימום שנייה וכלובים נקיים עם מצעים סטריליים.
      שים לב: אזור זה יכול גם לאכלס פריטים כגון מעקר חרוזים.

2. הזרקת וריד פורטל

1. שעה לפני הזריקות המתוכננות, לטפל עכברים נקבה Balb/c בגילאי 8 - 15 שבועות עם 100 μl של 0.015 מ"ג / מ"ל buprenorphine, תת עורית, לטיפול בכאב.
   שים לב: פרוטוקול הזרקה זה עשוי להיות מיושם על כל זן של עכבר נקבה או זכר בכל גיל, באמצעות קווי התא המתאים לשינויים בזן.
2. הכן את תאי הגידול להזרקה בהתבסס על פרוטוקולים עבור קו התא או explant הגידול של בחירה. בדוק את כל קווי תאי הגידול לפני הממשל לנוכחות של פתוגנים מורין כדי להפחית את הסיכון של החדרת פתוגנים כאלה למושבת בעלי החיים.
   1. עבור קווי תאים סרטניים סינגניים Balb/c כולל D2A1, D2.OR, ו 4T1 תאים סרטניים, להפשיר תאים לתוך צלחת 10 ס"מ תרבית רקמה 3 ימים לפני ההזרקה כך התאים למחרת הם ב ~ 90 - 100% מפגש.
   2. 1 יום לאחר תאים סרטניים להפשיר תאים לשטוף פעם אחת עם 1x פוספט אגירה מלוחים (PBS) ולנסות את התאים הגידול confluent באמצעות 2 מיליליטר של 0.05% טריפסין ב 37 °C (69 °F) במשך 5 דקות. יש להוסיף 8 מ"ל של מדיה מלאה (DMEM גלוקוז גבוה, 10% סרום בקר עוברי, 2 מ"מ ל-גלוטמין ו-1x פניצילין/סטרפטומיצין) ומעבר 1:10 למנה טרייה של 10 ס"מ עם 10 מ"ל של מדיה שלמה.
   3. ביום הזריקות, לשטוף את התאים פעם אחת עם 1x PBS ולנסות כמתואר לעיל.
   4. Resuspend תאים טריפסיניזציה ב 8 מ"ל של מדיה מלאה, להסתובב במשך 5 דקות ב 1,500 x g, להסיר את המדיה ולהשתיל מחדש ב 5 מיליליטר 1x PBS.
   5. לספור תאים על hemocytometer באמצעות הדרה כחול trypan להערכת הכדאיות. Resuspend תאים להזרקה ב 1x PBS בריכוז ונפח שנקבעו מראש.
      הערה: 5 - 10 μl מומלץ כמו נפחי הזרקה קטנים יותר למנוע נזק מיותר לכבד.
   6. שמור תאים על הקרח למשך הזריקות. לאחר השלמת הזריקות, להחזיר מדגם של תאים למעבדה ומניחים בתרבות במדיה מלאה במשך יום אחד כדי להבטיח את הכדאיות.
3. מניחים את העכבר תחת הרדמה עם 2 - 2.5% isoflurane (2-כלורו-2-(difluoromethoxy)-1,1-טריפלואורו-אתאן) מועבר בחמצן. לשמור על טמפרטורת הגוף באמצעות כרית החימום.  ודא הרדמה מלאה על ידי הערכה לתגובה לצביטת בוהן, ולאחר מכן לשמור על הרדמה ב 2 - 2.5% isoflurane.
   שים לב: חשוב לעקוב אחר קצב הנשימה של בעלי החיים ולהתאים את קצב הזרימה של isoflurane בהתאם לאורך כל ההליך.
4. מניחים כמות קטנה של דמעות מלאכותיות או משחה וטרינרית על כל עין, כדי למנוע ייבוש מוגזם של העיניים במהלך ההליך הכירורגי.
5. מניחים את העכבר בתנוחה על-חושית, על גבו עם בטן חשופה.
6. הסר שיער בצד השמאלי הגחוני של המכרסם מחלל הצלעות השני עד לפטמת בלוטת החלב המפשעה הרביעית על ידי ניגוב האזור עם depilatory כימי. אפשר depilatory לשבת במשך 1 - 2 דקות ולאחר מכן להסיר לחלוטין עם גזה ו- H2O. שלב זה יכול להיעשות 1 - 2 ימים מראש כדי לחסוך זמן אם ניתוחים רבים מתוכננים.
7. קח אחד 2 x 2" ספוג גזה סטרילי (ספוג 2% Chlorhexidine) ולנגב את העכבר באתר של הסרת שיער. לעקר את כל האזור שמסביב, כולל הזנב, כדי למזער את הזיהום החיידקי של מכשירים.
8. לנגב את האתר של הסרת שיער והסביבה למטה עם כרית הכנה אלכוהול.
9. חזור על 2% Chlorhexidine ואלכוהול צעדים שוב ולסיים עם ניגוב כלורקסידין הסופי למטה בסך הכל שלושה 2% Chlorhexidine ושני רפידות הכנה אלכוהול שוטף. האם לנגב Chlorhexidine הסופי כך הכימיקל אינו נוטף סביב האתר הכירורגי, כדי למנוע מקבל כלורקסידין על איברים פנימיים.
   שים לב: יישום של כמויות גדולות של כלורקסידין ואלכוהול לעור ולפרווה שמסביב עלול לגרום לירידה משמעותית בטמפרטורת הגוף. אין לנגב עם נפח עודף בשלבים 2.7-2.9. לשמור על טמפרטורת הגוף עם כרית חימום.
10. באמצעות כפפות סטריליות אזמל מעוקר עם להב סטרילי, לעשות חתך אחד 1 אינץ 'לתוך העור בין המטוסים החציוני sagittal בצד שמאל של העכבר, החל ממש מתחת לצלעות ומסתיים ממש מעל המישור של פטמה בלוטת החלב המפשעה הרביעית.
11. באמצעות מספריים מעוקרים autoclaved או חרוזים ומלקחיים, לבצע חתך דומה 1 אינץ 'לתוך הצפק. הימנע חיתוך לתוך כרית שומן mammary ולהבטיח לא לחתוך את המעיים, הכבד, או דיאפרגמה.
12. מניחים כרית גזה בגודל 4x4 אינץ' ספוגה מלוחים סטריליים בצד שמאל של העכבר, שם נוצר החתך, כך שניתן להניח איברים פנימיים על הגזה ולא לבוא במגע עם העור שמסביב או באזור הניתוחי.
13. הכן תאים סרטניים על ידי pipetting למעלה ולמטה מספר פעמים כמו תאים סרטניים יתיישבו במהלך הכנת העכבר. הכן מזרק מחט נשלף 25 μl ומחט 32-מד עם תאים סרטניים. לדחוף על המזרק עד תאים סרטניים נמצאים בקצה המחט ואת הוכנה היא בנפח המתאים להזרקה; למנוע הזרקה של בועות אוויר.
14. לנגב את החלק החיצוני של המחט עם כרית אלכוהול סטרילית כדי להסיר את כל התאים הגידול החיצוניים. נקוט זהירות כדי למנוע מקלות מחט.
15. החזיקו את הצד החציוני של החתך, כולל עור ובטנת הצפק, בצד עם המלקחיים והשתמשו במטלית כותנה סטרילית כדי למשוך בזהירות את המעיים הגדולים והקטנים החוצה, ומניחים אותם על הגזה הסטרילית ספוגה מלוחים סטריליים. לשלוף מעיים גדולים וקטנים עד וריד הפורטל הוא דמיין.
16. מכסים את האיברים הפנימיים ב גזה ספוגה מלוחים כדי לשמור על לחות פנימית ועקרות.
17. יש עוזר, גם לובש כפפות סטריליות, להחזיק את המעיים עטופים גזה ספוג מלוחים בעדינות מהדרך עם צמר גפן סטרילי הטה לחשוף באופן מלא את וריד הפורטל. בנוסף, ייתכן שיהיה צורך להשתמש hemostat autoclaved או מלקחיים להחזיק רקמה בצד בצד החציוני של החתך.
18. הכנס את המחט טעון עם תאים סרטניים ~ 3 - 5 מ"מ לתוך וריד הפורטל ~ 10 מ"מ מתחת לכבד בזווית < 5 ° לווריד, עם שיפוע פונה כלפי מעלה. לאט להזריק את הנפח המלא המכיל תאים סרטניים. אפשר לדם לזרום על פני ראש המחט במשך מספר שניות, כדי למנוע זרימה לאחור של תאים סרטניים מתוך הווריד. למזער את הזזת המחט בווריד במהלך ההזרקה. שוב, נקוט זהירות כדי למנוע מקלות מחט.
    שים לב: הדמיה של וריד הפורטל נעשית ללא הגדלה, אולם מיקרוסקופ סטריאו עשוי לשמש אם עדיף.
19. הסר את המחט בעת ובעונה אחת הצבת מוליך קצה כותנה סטרילי על הווריד בלחץ. עם העוזר עדיין מחזיק את המעיים בצד מקום חתיכה אחת של 0.5 - 1 cm2 גזה hemostatic מעל אתר ההזרקה על הווריד.
    שים לב: אבקת hemostatic גם ניסה עבור שלב זה בפרוטוקול אבל לא היה יעיל לעצור איבוד דם ורידי לאחר הזרקה.
20. החזק את גזה hemostatic באתר ההזרקה עם לחץ של אפליקטור קצה כותנה סטרילי במשך 5 דקות.
21. להעריך את סגירת הווריד על ידי הרמת גזה hemostatic בזהירות, אם גזה מקלות על הרקמה שמסביב, כמות קטנה של מלוחים סטריליים ניתן להשתמש כדי להשרות ולהרים את הגזה.
22. אם איבוד דם מתרחש בשלב זה, מניחים חתיכה נוספת של גזה hemostatic באתר עם לחץ במשך 5 דקות נוספות. כאשר זרימת הדם נפסקה לחלוטין, להסיר את הגזה מן העכבר.
    שים לב: איבוד דם במהלך ההליך הכירורגי יש להעריך בזהירות ואם נפח אובדן הדם הכולל מותר מתקיים או חריגה (בהתבסס על נהלי הפעלה סטנדרטיים רגולטוריים עבור לוחות הבדיקה המוסדיים של החוקר) העכבר חייב להיות מורדם בזמן תחת הרדמה על ידי זלוף לב.
23. לאחר אתר ההזרקה נחשב שלם, ללא דם עוזב את אתר ההזרקה, למקם את האיברים הפנימיים בעדינות בחזרה לתוך חלל הבטן.
24. לתפור את רירית הצפק ולאחר מכן את העור עם תפר סטרילי 4-0 vicryl ומחט להתחדד באמצעות דפוס תפר פשוט רציף או מופרע. בדרך כלל, סגירת החתך דורשת 10-15 תפרים.
25. להזריק 100 μl של bupivacaine (5 מ"ג / מ"ל) לאורך אתר החתך לטיפול בכאב מקומי באמצעות מזרק אינסולין. להזריק 0.5 מ"ל של מלוחים סטריליים תת עורית באמצעות מזרק 1 מ"ל עם מחט 26-מד עבור הידרציה. ניתוחים לקחת 15 - 25 דקות כדי להשלים.
26. כדי לשמור על תנאים סטריליים לאורך כל הניתוח, יש לוודא כי כל הכלים והחומרים שבאים במגע עם העכבר, כולל ידיים כפפה, מנוקים כראוי לפני המגע. במידת האפשר להשתמש בחומרים סטריליים וכפפות, או לנצל באופן מינימלי תמיסת אתנול 70% או 10% אקונומיקה פתרון לנקות.
27. אם ניתוחים מרובים מתוכננים לפגישה אחת לחדש את האזור הכירורגי הראשוני עם וילון סטרילי טרי, מזרקי אינסולין, 1 מ"ל מזרקים, מלוחים סטריליים, ספוגי גזה סטריליים בגודל 2x2" , גזה סטרילית בגודל 4x4 מ"ל, גזה היסטטית חתוכה ל-0.5 - 1 ס"מ2 חתיכות, תפרי ויקריל 4-0 עם מחט טפר ו-2% כלורהקסידין. חרוז-לעקר את המספריים, מלקחיים, hemostat בין ניתוחים ולאפשר להתקרר כראוי לפני שימוש חוזר.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml Syringe w/ 26-gauge Needle	BD Syringe	309597	309597
Alcohol Prep Pads	Fisher Scientific	06-669-62	For cleaning of abdomen prior to surgical incision
All Purpose Sponges, Sterile	Kendall	8044	4" x 4", use dipped in sterile saline to keep large and small intestines protected and hydrated during surgery
Artificial Tears	Rugby	370114	Mineral oil 15%, white petrolatum 83%; use to protect eyes during surgery
Buprenorphine HCl, 0.3 mg/ml	Mfg. by Reckitt Benckiser	NDC-12496-0757-1	Use at 0.05 - 0.1 mg/kg body weight, 1 - 2x daily for 72 hr, injected subcutaneously
Bupivacaine HCl, 0.5% (5 mg/ml)	Mfg. by Humira Inc	NDC-04091163-01	Use at 0.5%, 1x immediately after surgery, 10 μl injected subcutaneously at incision site
Celox™ Rapid Hemostatic Gauze	Medtrade Products Ltd.	FG08839011	Cut into 5 mm² pieces, use to stop blood flow out of the portal vein with pressure following injection
Chlorhexidine, 2% Solution	Vet One	1CHL008	Use caution, do not get chlorhexidine in mucous membranes or ears of the mouse
Cotton Tipped Applicators, Sterile	Fisher Scientific	23-400-114	6" Wooden Shaft 2 pc/envelope
DMEM, High-Glucose	HyClone	SH30243.01	Cell culture media base for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines
Dry Glass Bead Sterilizer			Use between surgeries to sterilize stainless steel tools, use caution, extremely hot; multiple suppliers
Ethanol, 70% solution			Use caution flammable; use to clean surgical area as needed; multiple suppliers
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH30071.03	Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 Journal of Visualized Experiments www.jove.com Copyright © 2016 Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Unported License Page 2 of 3 mammary tumor cell lines, use at 10% in DMEM high glucose
Gauze, Sterile	Kendall	2146	2" x 2", use dipped in chlorhexidine 2% solution for cleaning of abdomen prior to surgical incision
Isoflurane	Piramal	NDC-66794-017-25	Administered at 2.5%
Isoflurane Vaporizer	VetEquip	911103	Use caution, vaporizes anesthetic gases
Removable Needle Syringe, 25 μl, Model 1702	Hamilton	7654-01	For portal vein injection; use caution, paricularly while working with tumor cell-loaded needles, sharp when needle is attached
Scalpel handle			Stainless steel; multiple suppliers
Scalpel blade, #15			Carbon steel, sterile, size 15; multiple suppliers
Small Hub Removable Needles, 32-gauge	Hamilton	7803-04	For portal vein injection, 1" length, point style 4, 12° angle, 33- to 34- gauge reusable needles can also be used; use caution, paricularly while working with tumor cell loaded needles, sharp
Sterile Saline	Fisher Scientific	BP358-212	0.9% NaCl solution; alternatively, can be homemade and sterile filtered
Surgical Gloves, Sterile			Multiple suppliers
Sutures, Sterile	Ethicon	J310H	4-0 27" coated vicryl w/ 22 mm 1/2c taper ethalloy needle; use caution, sharp
Table Top Portable Anesthesia Machine	VetEquip	901801	Use with isoflurane vaporizer for mouse anesthesia
Thumb Dressing Forceps			Stainless steel, serrated, blunted; multiple suppliers
Towel Drapes, Sterile	Dynarex	4410	18" x 26", to cover heating pad and provide a sterile workspace during surgery