Портал Vein Инъекции: Метод для изучения метастазов рака в печень

Overview

Это видео описывает хирургическую процедуру для доставки молочных опухолевых клеток в печень мурина через инъекцию вены портала. Эта модель позволяет изутовить поздние стадии метастазирования печени.

Protocol

1. Подготовка хирургической области и инструментов

1. Подготовь ножницы, типсы и гемостат, застраховав при 124 градусах Цельсия в течение 30 минут, за 1 - 2 дня до запланированных операций. Обеспечь доступ к автоклавным или стерильным постельным принадлежностям, клеткам и пище для послеоперационного восстановления.
2. Подготовь асептическую хирургическую область, желательно в ламинарный капюшон потока.
   1. Протрите вниз все поверхности хирургической области с 10% отбеливатель, в том числе грелка, источник света, анестезия трубки и нос конуса, и любой другой части хирургического люкс, который будет в непосредственной близости от хирургической процедуры во время его ирования.
   2. В асептической хирургической области поместите очищенную грелку со стерильной шторой, источником света, анестезией и носовым раствором, инсулиновыми шприцами, 1 мл шприцев, bupivacaine, искусственные слезы, стерильный солевой раствор, 2 х 2 "стерильные марлевые губки, 4 х 4" стерильная марля, гемостатическая марля, разрезанная на 0,5 - 1 см2 штуки, ножницы, типсы, гемостат, 4-0 викриловые швы с конусной иглой и 50 мл 2% хлоргексидина глюконата в автозапись.
   3. Убедитесь, что в этом пространстве есть место для подготовленных опухолевых клеток, хранящихся на льду.
   4. На скамейке, прилегающей к хирургической зоне, подготовьтесь к восстановлению с помощью второй грелки и чистых клеток со стерильными постельными принадлежностями.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта область может также дом предметы, такие как бисер стерилизатор.

2. Портал вены инъекции

1. За час до запланированных инъекций, лечить Balb / C самок мышей в возрасте от 8 до 15 недель с 100 мл 0,015 мг / мл бупренорфина, подкожно, для лечения боли.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол инъекции может быть применен к любому штамму женской или мужской мыши в любом возрасте, используя соответствующие клеточные линии для изменения штамма.
2. Подготовка опухолевых клеток для инъекций на основе протоколов для клеточной линии или опухоли explant выбора. Проверьте все линии опухолевых клеток до введения на наличие патогенов мурина, чтобы уменьшить риск введения таких патогенов в колонию животных.
   1. Для сингенеических balb/c линий опухолевых клеток, включая D2A1, D2.OR и опухолевые клетки 4T1, талые клетки в пластину культуры ткани 10 см за 3 дня до инъекции, так что на следующий день клетки находятся на 90 - 100% слияние.
   2. 1 день после опухолевых клеток оттепели мыть клетки один раз с 1x фосфат буферного солевого раствора (PBS) и трипсинировать слияние опухолевых клеток, используя 2 мл 0,05% трипсина при 37 градусов по Цельсию в течение 5 мин. Добавьте 8 мл полных средств массовой информации (DMEM с высоким содержанием глюкозы, 10% сыворотки крупного рогатого скота плода, 2 мМ Л-глутамин и 1x пенициллин/стрептомицин) и прохождение 1:10 в свежее 10 см блюдо с 10 мл полного средства массовой информации.
   3. В день инъекций, мыть клетки один раз с 1x PBS и трипсинизировать, как описано выше.
   4. Resuspend трипсинизированных клеток в 8 мл полного средства массовой информации, спина в течение 5 мин при 1500 х г, удалить средства массовой информации и повторного перерасхода в 5 мл 1x PBS.
   5. Подсчитайте клетки на гемоцитометре, используя trypan голубое исключение для оценки жизнеспособности. Повторное использование клеток для инъекций в 1x PBS при заранее определенных концентрациях и объемах.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 5 - 10 мкл рекомендуется, как меньшие объемы инъекций предотвратить ненужные повреждения печени.
   6. Храните клетки на льду в течение всего срока инъекций. После завершения инъекций, вернуть образец клеток в лабораторию и место в культуре в полном средствах массовой информации в течение 1 дня, чтобы обеспечить жизнеспособность.
3. Поместите мышь под наркоз с 2 - 2,5% изофлуран (2-хлоро-2-(дифторометроксия)-1,1-трифтор-этан) поставляется в кислороде. Поддерживайте температуру тела с помощью грелки.  Обеспечить полную анестезию путем оценки реакции на щепотку нося, а затем сохранить анестезию на 2 - 2,5% изофлюран.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно контролировать скорость дыхания животных и соответствующим образом регулировать скорость потока изофлюрана на протяжении всей процедуры.
4. Поместите небольшое количество искусственных слез или ветеринар мази над каждым глазом, чтобы избежать чрезмерной сушки глаз во время хирургической процедуры.
5. Поместите мышь в положение на спине, на спине с открытым животом.
6. Удалите волосы на брюшной левой стороне грызуна со второго ребра пространства до 4-й паховой молочной железы сосок, вытирая области с химическим депиляния. Разрешить depilatory сидеть в течение 1 - 2 мин, а затем удалить полностью с марлей и H2O. Этот шаг можно сделать за 1 - 2 дня вперед, чтобы сэкономить время, если запланированы многочисленные операции.
7. Возьмите один 2 х 2 "стерильной марлевой губкой (пропитанной 2% хлоргексидин) и протрите мышь в месте удаления волос. Стерилизовать всю прилегающую территорию, включая хвост, чтобы свести к минимуму бактериальное загрязнение инструментов.
8. Протрите сайт удаления волос и прилегающих районов вниз с алкоголем подготовительной площадке.
9. Повторите 2% хлоргексидин и алкоголь шаги еще раз и закончить с окончательным хлоргексидин протрите вниз в общей сложности три 2% хлоргексидин и два алкоголя prep pad моет. У окончательного хлоргексидина протрите так, что химическое вещество не капает вокруг хирургического сайта, чтобы избежать получения хлоргексидина на внутренние органы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Применение большого количества хлоргексидина и алкоголя на кожу и окружающий мех может привести к значительному падению температуры тела. Не протирать с избыточным объемом во время шагов 2.7-2.9. Поддерживайте температуру тела с помощью грелки.
10. Используя стерильные перчатки и стерилизованный скальпель со стерильным лезвием, сделайте один 1-дюймовый разрез в кожу между медианной и сагиттаальной плоскостями на левой стороне мыши, начиная чуть ниже ребер и заканчивая чуть выше плоскости четвертой паховой молочной железы соцы.
11. Используя автоматические или бисером стерилизованные ножницы и типсы, сделать аналогичный 1-дюймовый разрез в брюшной полости. Избегайте резки в молочной жир площадку и убедитесь, что не сократить кишечник, печень, или диафрагмы.
12. Поместите 4 х 4 "марлевой колодки пропитанной стерильным солевым раствором на левой стороне мыши, где разрез был сделан, так что внутренние органы могут быть размещены на марлю и не вступают в контакт с окружающей кожей или хирургической области.
13. Подготовка опухолевых клеток путем трубопроводов вверх и вниз несколько раз, как опухолевые клетки будут осесел во время подготовки мыши. Подготовь 25 мкл съемный шприц иглы и 32-го калибра иглы с опухолевыми клетками. Нажмите на шприц, пока опухолевые клетки находятся на кончике иглы и поршень находится в соответствующем объеме для инъекций; избежать инъекций пузырьков воздуха.
14. Протрите внешнюю часть иглы стерильной спиртовой прокладкой для удаления любых внешних опухолевых клеток. Используйте осторожность, чтобы избежать иглы палочки.
15. Держите медианную сторону разреза, включая кожу и перитонеальную подкладку, в сторону с типсами и используйте стерильный ватный тампон, чтобы тщательно вытащить большой и тонкий кишечник, поместив их на стерильную марлю, пропитанную стерильным солевым раствором. Вытяните большой и тонкий кишечник до тех пор, пока портал вены визуализированы.
16. Обложка внутренних органов в солевой пропитанной марлей для поддержания внутренней влаги и стерильности.
17. Иметь помощника, также носить стерильные перчатки, держать кишечник, завернутый в солевой пропитанной марлей мягко в сторону с стерильным ватным тампоном наконечником, чтобы полностью выявить портал вены. Кроме того, может потребоваться использовать автоклавный гемостат или типсы, чтобы удерживать ткани в стороне на средней стороне разреза.
18. Вставьте иглу, нагруженную опухолевыми клетками, на 3 - 5 мм в вену портала и на 10 мм ниже печени под углом 5 мм к вене, с скошенной лицом вверх. Медленно вводите полный объем, содержащий опухолевые клетки. Позвольте крови течь мимо головы иглы в течение нескольких секунд, чтобы избежать обратного потока опухолевых клеток из вены. Свести к минимуму перемещение иглы в вену во время инъекции. Опять же, используйте осторожность, чтобы избежать иглы палочки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализация вены портала делается без увеличения, однако стерео микроскоп может быть использован, если предпочтительнее.
19. Удалите иглу, одновременно помещая стерильный хлопчатобумажный наконечник аппликатора на вену с давлением. С помощником по-прежнему удерживая кишечник в сторону место один кусок 0,5 - 1 см2 гемостатической марли над местом инъекции на вену.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гемостатический порошок был также предпринят для этого шага в протоколе, но не был эффективным в остановке венозной кровопотери после инъекции.
20. Держите гемостатической марли в месте инъекции с давлением от стерильного хлопка наконечник аппликатора в течение 5 мин.
21. Оцените закрытие вены, тщательно подняв гемостатической марли, если марля прилипает к окружающим тканям, небольшое количество стерильного солевого раствора может быть использовано для замачивания и подъема марли.
22. Если в это время происходит кровопотеря, поместите дополнительный кусок гемостатической марли на участке с давлением еще на 5 минут. Когда кровоток полностью прекратился, удалите марлю с мыши.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кровопотеря во время хирургической процедуры должна быть тщательно оценена, и если общий разрешенный объем потери крови будет выполнен или превышен (на основе нормативных стандартных операционных процедур для институциональных советов по обзору следователя) мышь должна быть усыпана во время анестезии сердечным перфузией.
23. После того, как место инъекции считается нетронутым, без крови, покидая место инъекции, поместите внутренние органы осторожно обратно в брюшную полость.
24. Шов брюшной подкладке, а затем кожа со стерильными 4-0 vicryl шва и конус иглы с помощью простой непрерывной или прерванной шовной узор. Как правило, для закрытия разреза требуется 10-15 швов.
25. Ввпрыснуть 100 мкл бутивакаина (5 мг/мл) вдоль места разреза для местного управления болью с помощью инсулинового шприца. Ввимите 0,5 мл стерильного солевого раствора подкожно с помощью 1 мл шприца с 26-калибровочной иглой для гидратации. Операции занять 15 - 25 минут, чтобы завершить.
26. Для поддержания стерильных условий на протяжении всей операции, убедитесь, что все инструменты и материалы, в контакт с мышью, в том числе в перчатках руки, очищаются надлежащим образом до контакта. Там, где это возможно, используйте стерильные материалы и перчатки, или минимально использовать 70% этанола раствор или 10% отбеливатель раствор для очистки.
27. Если на один сеанс запланировано несколько операций, переделать начальную хирургическую зону со свежей стерильной драпировкой, инсулиновыми шприцами, 1 мл шприцев, стерильным солевым раствором, 2 х 2 "стерильными марлевыми губками, 4 х 4" стерильной марлей, гемостой марлей, разрезанной на 0,5 - 1 см2 штуки, 4-0 вихриловыми швами с конусной иглой и 2% хлорксидина. Бисер-стерилизовать ножницы, типсы, и гемостат в период между операциями и позволяют адекватно остыть до повторного использования.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml Syringe w/ 26-gauge Needle	BD Syringe	309597	309597
Alcohol Prep Pads	Fisher Scientific	06-669-62	For cleaning of abdomen prior to surgical incision
All Purpose Sponges, Sterile	Kendall	8044	4" x 4", use dipped in sterile saline to keep large and small intestines protected and hydrated during surgery
Artificial Tears	Rugby	370114	Mineral oil 15%, white petrolatum 83%; use to protect eyes during surgery
Buprenorphine HCl, 0.3 mg/ml	Mfg. by Reckitt Benckiser	NDC-12496-0757-1	Use at 0.05 - 0.1 mg/kg body weight, 1 - 2x daily for 72 hr, injected subcutaneously
Bupivacaine HCl, 0.5% (5 mg/ml)	Mfg. by Humira Inc	NDC-04091163-01	Use at 0.5%, 1x immediately after surgery, 10 μl injected subcutaneously at incision site
Celox™ Rapid Hemostatic Gauze	Medtrade Products Ltd.	FG08839011	Cut into 5 mm² pieces, use to stop blood flow out of the portal vein with pressure following injection
Chlorhexidine, 2% Solution	Vet One	1CHL008	Use caution, do not get chlorhexidine in mucous membranes or ears of the mouse
Cotton Tipped Applicators, Sterile	Fisher Scientific	23-400-114	6" Wooden Shaft 2 pc/envelope
DMEM, High-Glucose	HyClone	SH30243.01	Cell culture media base for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines
Dry Glass Bead Sterilizer			Use between surgeries to sterilize stainless steel tools, use caution, extremely hot; multiple suppliers
Ethanol, 70% solution			Use caution flammable; use to clean surgical area as needed; multiple suppliers
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH30071.03	Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 Journal of Visualized Experiments www.jove.com Copyright © 2016 Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Unported License Page 2 of 3 mammary tumor cell lines, use at 10% in DMEM high glucose
Gauze, Sterile	Kendall	2146	2" x 2", use dipped in chlorhexidine 2% solution for cleaning of abdomen prior to surgical incision
Isoflurane	Piramal	NDC-66794-017-25	Administered at 2.5%
Isoflurane Vaporizer	VetEquip	911103	Use caution, vaporizes anesthetic gases
Removable Needle Syringe, 25 μl, Model 1702	Hamilton	7654-01	For portal vein injection; use caution, paricularly while working with tumor cell-loaded needles, sharp when needle is attached
Scalpel handle			Stainless steel; multiple suppliers
Scalpel blade, #15			Carbon steel, sterile, size 15; multiple suppliers
Small Hub Removable Needles, 32-gauge	Hamilton	7803-04	For portal vein injection, 1" length, point style 4, 12° angle, 33- to 34- gauge reusable needles can also be used; use caution, paricularly while working with tumor cell loaded needles, sharp
Sterile Saline	Fisher Scientific	BP358-212	0.9% NaCl solution; alternatively, can be homemade and sterile filtered
Surgical Gloves, Sterile			Multiple suppliers
Sutures, Sterile	Ethicon	J310H	4-0 27" coated vicryl w/ 22 mm 1/2c taper ethalloy needle; use caution, sharp
Table Top Portable Anesthesia Machine	VetEquip	901801	Use with isoflurane vaporizer for mouse anesthesia
Thumb Dressing Forceps			Stainless steel, serrated, blunted; multiple suppliers
Towel Drapes, Sterile	Dynarex	4410	18" x 26", to cover heating pad and provide a sterile workspace during surgery