Portal ven injektion: En metod för att studera cancer metastasering till levern

Overview

Denna video beskriver ett kirurgiskt ingrepp för att leverera bröst tumör celler till murine lever via portal ven injektion. Denna modell tillåter undersökning av sena stadier av lever metastasering.

Protocol

1. Förberedelse av operationsområdet och instrumenten

1. Förbered saxen, tången och hemostaten genom att autoklavera vid 124 °C i 30 min, 1 - 2 dagar före de planerade operationerna. Säkerställa tillgång till autoklaverat eller sterilt strö, burar och mat för postkirurgisk återhämtning.
2. Förbered ett aseptiskt kirurgiskt område, helst i en laminär flödeshuva.
   1. Torka av alla ytor i operationsområdet med 10% blekmedel, inklusive värmedynan, ljuskällan, anestesirören och näskonen och någon annan del av operationssviten som kommer att vara i närheten av det kirurgiska ingreppet medan det utförs.
   2. Placera den rengjorda värmedynan med sterilt draperi, ljuskälla, anestesirör och näskon, insulinsprutor, 1 ml sprutor, bupivakain i det aseptiska operationsområdet. konstgjorda tårar, steril saltlösning, 2 x 2" sterila gasvävssvampar, 4 x 4" steril gasväv, hemostatisk gasväv skuren i 0,5 - 1 cm2 bitar, sax, tång, hemostat, 4-0 vicryl suturer med kona nål och 50 ml 2% Klorhexidinglukonat i en autoklaverad behållare.
   3. Se till att det finns plats i detta utrymme för förberedda tumörceller lagrade på is.
   4. På bänken intill operationsområdet, förbered återhämtningsområdet med en andra värmeplatta och rena burar med sterila sängkläder.
      OBS: Detta område kan också hysa föremål som en pärlsterilisator.

2. Portal ven injektion

1. En timme före de planerade injektionerna, behandla Balb/c honmöss i åldern 8- 15 veckor med 100 μl 0, 015 mg/ml buprenorfin, subkutant, för smärtlindring.
   OBS: Detta injektionsprotokoll kan tillämpas på alla stammar av honmus eller hanmus i alla åldrar, med lämpliga cellinjer för förändringar i stammen.
2. Förbered tumörcellerna för injektion baserat på protokoll för cellinjen eller tumör explant av val. Testa alla tumör cellinjer före administrering för förekomst av murin patogener för att minska risken för att införa sådana patogener i djurkolonin.
   1. För syngeneiska Balb/c tumör cellinjer inklusive D2A1, D2.OR och 4T1 tumörceller, tina celler i en 10 cm vävnad kulturplatta 3 dagar före injektion så att följande dag celler är på ~ 90 - 100% beredskap.
   2. 1 dag efter tumör cell tina tvätta celler en gång med 1x fosfat buffrad saltlösning (PBS) och trypsinize de sammanflöde tumör cellerna med 2 ml 0,05% trypsin vid 37 °C i 5 min. Tillsätt 8 ml kompletta medier (DMEM hög glukos, 10% fetala nötkreatur serum, 2 mM L-glutamin och 1x penicillin/streptomycin) och passage 1:10 i en färsk 10 cm skål med 10 ml kompletta medier.
   3. På injektionsdagen tvätta cellerna en gång med 1x PBS och trypsinize enligt beskrivningen ovan.
   4. Återanvända trypsiniserade celler i 8 ml komplett media, snurra i 5 min vid 1 500 x g, ta bort mediet och återanvänd i 5 ml 1x PBS.
   5. Räkna celler på en hemocytometer med trypan blå uteslutning för livskraftsbedömning. Återanvända celler för injektion i 1x PBS vid en förutbestämd koncentration och volym.
      OBS: 5 - 10 μl rekommenderas eftersom mindre injektionsvolymer förhindrar onödiga skador på levern.
   6. Håll cellerna på is under injektionernas varaktighet. Efter avslutad injektion, returnera ett prov av celler till laboratoriet och placera i kultur i komplett media i 1 dag för att säkerställa livskraft.
3. Placera musen under anestesi med 2 - 2,5% isofluran (2-klor-2-(difluoromethoxy)-1,1,1-trifluoro-etan) levereras i syre. Bibehåll kroppstemperaturen med värmedynan.  Säkerställ fullständig anestesi genom att bedöma för en reaktion på en tå nypa, och sedan upprätthålla anestesi vid 2- 2,5% isofluran.
   OBS: Det är viktigt att övervaka djurens andningshastighet och justera isofluranflödet i enlighet därmed under hela proceduren.
4. Placera en liten mängd konstgjorda tårar eller veterinärsalva över varje öga för att undvika överdriven torkning av ögonen under det kirurgiska ingreppet.
5. Placera musen i en supin position, på ryggen med buken exponerad.
6. Ta bort håret på den ventrala vänstra sidan av gnagaren från det andra revbensutrymmet ner till den 4: e inguinala bröstkörteln genom att torka av området med kemisk depilatory. Låt depilatoriet sitta i 1 - 2 min och ta sedan bort helt med gasväv och H2O. Detta steg kan göras 1 - 2 dagar i förväg för att spara tid om många operationer planeras.
7. Ta en 2 x 2" steril gasvävssvamp (blötläggd i 2% klorhexidin) och torka av musen på platsen för hårborttagning. Sterilisera hela omgivningen, inklusive svansen, för att minimera bakteriell förorening av instrument.
8. Torka av platsen för hårborttagning och omgivande område med en alkoholprep pad.
9. Upprepa 2% Klorhexidin och alkohol steg igen och avsluta med en slutlig klorhexidin torka av för totalt tre 2% Klorhexidin och två alkohol prep pad tvättar. Torka av den slutliga klorhexidinservetten så att kemikalien inte droppar runt operationsstället för att undvika att få klorhexidin på inre organ.
   OBS: Applicering av stora mängder klorhexidin och alkohol på huden och omgivande päls kan leda till en betydande minskning av kroppstemperaturen. Torka inte med överskottsvolym under steg 2.7-2.9. Behåll kroppstemperaturen med en värmedyna.
10. Använd sterila handskar och en steriliserad skalpell med sterilt blad, gör ett enda 1-tums snitt i huden mellan median- och sagittalplan på vänster sida av musen, som börjar strax under revbenen och slutar strax ovanför planet på den fjärde inguinala bröstkörteln.
11. Använd autoklaverad eller pärlsteriliserad sax och tång, gör ett liknande 1-tums snitt i peritoneum. Undvik att skära i bröstfettdynan och se till att inte skära tarmarna, levern eller membranet.
12. Placera en 4 x 4" gasväv blötläggd i steril saltlösning på vänster sida av musen, där snittet gjordes, så att inre organ kan placeras på gasväven och inte komma i kontakt med den omgivande huden eller operationsområdet.
13. Förbered tumörceller genom att pipetta upp och ner flera gånger när tumörceller kommer att bosätta sig under beredningen av musen. Förbered en 25 μl avtagbar nålspruta och 32-gauge nål med tumörceller. Tryck på sprutan tills tumörcellerna är på nålens spets och kolven är på lämplig volym för injektion; undvika injektion av luftbubblor.
14. Torka utsidan av nålen med en steril alkoholplatta för att ta bort eventuella yttre tumörceller. Var försiktig så att nålstick undviks.
15. Håll snittets mittsida, inklusive hud och peritonealfoder, åt sidan med tången och använd en steril bomullspinne för att försiktigt dra ut de stora och tunntarmen och placera dem på den sterila gasväven som blötläggs i steril saltlösning. Dra ut stora och små tarmar tills portal venen visualiseras.
16. Täck de inre organen i den saltlösningsdränkta gasväven för att bibehålla inre fukt och sterilitet.
17. Ha en assistent, som också bär sterila handskar, håll tarmarna inslagna i saltlösningen blött gasväv försiktigt ur vägen med en steril bomullsspetsad bomullspinne för att helt avslöja portal venen. Dessutom kan det vara nödvändigt att använda autoklaverad hemostat eller tång för att hålla vävnaden åt sidan på mittsidan av snittet.
18. För in nålen laddad med tumörceller ~ 3 - 5 mm i portal venen ~ 10 mm under levern i en vinkel < 5° mot venen, med avfasning uppåt. Injicera långsamt hela volymen som innehåller tumörceller. Låt blodet flöda förbi nålhuvudet i flera sekunder för att undvika ryggflöde av tumörceller ur venen. Minimera flyttning av nålen i venen under injektionen. Återigen, var försiktig för att undvika nålstick.
    OBS: Visualisering av portal venen görs utan förstoring, men ett stereomikroskop kan användas om så önskas.
19. Ta bort nålen samtidigt som du placerar en steril bomullsspetsapplikator på venen med tryck. Med assistenten fortfarande håller tarmarna åt sidan placera en bit av 0,5 - 1 cm2 hemostatisk gasväv över injektionsstället på venen.
    OBS: Hemostatiskt pulver försöktes också för detta steg i protokollet men var inte effektivt för att stoppa venös blodförlust efter injektion.
20. Håll den hemostatiska gasväven på injektionsstället med tryck från en steril bomullsspetsapplikator i 5 minuter.
21. Utvärdera stängningen av venen genom att försiktigt lyfta den hemostatiska gasbindan, om gasväven fastnar på den omgivande vävnaden, kan en liten mängd steril saltlösning användas för att blötlägga och lyfta gasväven.
22. Om blodförlust uppstår vid denna tidpunkt, placera ytterligare en bit hemostatisk gasväv på platsen med tryck i ytterligare 5 minuter. När blodflödet har upphört helt, ta bort gasväven från musen.
    OBS: Blodförlust under det kirurgiska ingreppet måste noggrant bedömas och om den totala tillåtna blodförlustvolymen uppfylls eller överskrids (baserat på lagstadgade standardrutiner för prövarens institutionella granskningsnämnder) måste musen avlivas under narkos genom hjärtperfusion.
23. När injektionsstället bedöms vara intakt, utan att något blod lämnar injektionsstället, placera de inre organen försiktigt tillbaka i bukhålan.
24. Suturera peritonealfoder och sedan huden med steril 4-0 vicryl sutur och koniska nål med ett enkelt kontinuerligt eller avbrutet suturmönster. Vanligtvis kräver stängning av snittet 10-15 suturer.
25. Injicera 100 μl bupivakain (5 mg/ml) längs snittstället för lokal smärtlindring med en insulinspruta. Injicera 0,5 ml steril saltlösning subkutant med en 1 ml spruta med 26-gauge nål för hydrering. Operationer tar 15 - 25 minuter att slutföra.
26. För att bibehålla sterila förhållanden under hela operationen, se till att alla verktyg och material som kommer i kontakt med musen, inklusive handskhänder, rengörs på lämpligt sätt före kontakt. Använd om möjligt sterila material och handskar, eller använd en 70% etanollösning eller 10% blekmedelslösning för att rengöra.
27. Om flera operationer planeras för en enda session återskapa det ursprungliga kirurgiska området med färsk sterilt draperi, insulinsprutor, 1 ml sprutor, steril koklösning, 2 x 2" sterila gasvävssvampar, 4 x 4" steril gasväv, hemostatisk gasväv skuren i 0,5 - 1 cm2 stycken, 4-0 vicryl suturer med avsmalning nål och 2% klorhexidin. Pärlsterilisera saxen, tången och hemostaten mellan operationerna och låt svalna ordentligt före återanvändning.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml Syringe w/ 26-gauge Needle	BD Syringe	309597	309597
Alcohol Prep Pads	Fisher Scientific	06-669-62	For cleaning of abdomen prior to surgical incision
All Purpose Sponges, Sterile	Kendall	8044	4" x 4", use dipped in sterile saline to keep large and small intestines protected and hydrated during surgery
Artificial Tears	Rugby	370114	Mineral oil 15%, white petrolatum 83%; use to protect eyes during surgery
Buprenorphine HCl, 0.3 mg/ml	Mfg. by Reckitt Benckiser	NDC-12496-0757-1	Use at 0.05 - 0.1 mg/kg body weight, 1 - 2x daily for 72 hr, injected subcutaneously
Bupivacaine HCl, 0.5% (5 mg/ml)	Mfg. by Humira Inc	NDC-04091163-01	Use at 0.5%, 1x immediately after surgery, 10 μl injected subcutaneously at incision site
Celox™ Rapid Hemostatic Gauze	Medtrade Products Ltd.	FG08839011	Cut into 5 mm² pieces, use to stop blood flow out of the portal vein with pressure following injection
Chlorhexidine, 2% Solution	Vet One	1CHL008	Use caution, do not get chlorhexidine in mucous membranes or ears of the mouse
Cotton Tipped Applicators, Sterile	Fisher Scientific	23-400-114	6" Wooden Shaft 2 pc/envelope
DMEM, High-Glucose	HyClone	SH30243.01	Cell culture media base for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines
Dry Glass Bead Sterilizer			Use between surgeries to sterilize stainless steel tools, use caution, extremely hot; multiple suppliers
Ethanol, 70% solution			Use caution flammable; use to clean surgical area as needed; multiple suppliers
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH30071.03	Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 Journal of Visualized Experiments www.jove.com Copyright © 2016 Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Unported License Page 2 of 3 mammary tumor cell lines, use at 10% in DMEM high glucose
Gauze, Sterile	Kendall	2146	2" x 2", use dipped in chlorhexidine 2% solution for cleaning of abdomen prior to surgical incision
Isoflurane	Piramal	NDC-66794-017-25	Administered at 2.5%
Isoflurane Vaporizer	VetEquip	911103	Use caution, vaporizes anesthetic gases
Removable Needle Syringe, 25 μl, Model 1702	Hamilton	7654-01	For portal vein injection; use caution, paricularly while working with tumor cell-loaded needles, sharp when needle is attached
Scalpel handle			Stainless steel; multiple suppliers
Scalpel blade, #15			Carbon steel, sterile, size 15; multiple suppliers
Small Hub Removable Needles, 32-gauge	Hamilton	7803-04	For portal vein injection, 1" length, point style 4, 12° angle, 33- to 34- gauge reusable needles can also be used; use caution, paricularly while working with tumor cell loaded needles, sharp
Sterile Saline	Fisher Scientific	BP358-212	0.9% NaCl solution; alternatively, can be homemade and sterile filtered
Surgical Gloves, Sterile			Multiple suppliers
Sutures, Sterile	Ethicon	J310H	4-0 27" coated vicryl w/ 22 mm 1/2c taper ethalloy needle; use caution, sharp
Table Top Portable Anesthesia Machine	VetEquip	901801	Use with isoflurane vaporizer for mouse anesthesia
Thumb Dressing Forceps			Stainless steel, serrated, blunted; multiple suppliers
Towel Drapes, Sterile	Dynarex	4410	18" x 26", to cover heating pad and provide a sterile workspace during surgery