Portal Vein Injection: Um método para estudar metástase do câncer no fígado

Overview

Este vídeo descreve um procedimento cirúrgico para entregar células tumorais mamárias ao fígado murino através da injeção de veia portal. Este modelo permite a investigação de estágios tardios de metástase hepática.

Protocol

1. Preparação da Área Cirúrgica e Instrumentos

1. Prepare a tesoura, fórceps e hemostat por autoclaving a 124 °C por 30 min, 1 - 2 dias antes das cirurgias planejadas. Certifique-se de acesso a roupas de cama autoclavadas ou estéreis, gaiolas e alimentos para recuperação pós-cirúrgica.
2. Prepare uma área cirúrgica asséptica, de preferência em uma coifa de fluxo laminar.
   1. Limpe todas as superfícies da área cirúrgica com 10% de alvejante, incluindo a almofada de aquecimento, fonte de luz, tubos de anestesia e cone de nariz, e qualquer outra parte da suíte cirúrgica que estará próxima ao procedimento cirúrgico enquanto estiver sendo realizada.
   2. Na área cirúrgica asséptica, coloque a almofada de aquecimento limpa com cortina estéril, fonte de luz, tubos de anestesia e nariz, seringas de insulina, seringas de 1 ml, bupivacaína, lágrimas artificiais, soro fisiológico estéril, esponjas de gaze estéril de 2 x 2", gaze estéril de 4 x 4", gaze hemostática cortada em 0,5 - 1 cm2 pedaços, tesoura, fórceps, hemostat, suturas vicríl 4-0 com agulha de taper, e 50 ml 2% cloroxidina gluconato em um recipiente autoclavado.
   3. Certifique-se de que há espaço neste espaço para células tumorais preparadas armazenadas no gelo.
   4. No banco adjacente à área cirúrgica, prepare a área de recuperação com uma segunda almofada de aquecimento e gaiolas limpas com roupa de cama estéril.
      NOTA: Esta área também pode abrigar itens como um esterilizador de contas.

2. Injeção de Veia portal

1. Uma hora antes das injeções planejadas, trate camundongos fêmeas Balb/c de 8 a 15 semanas com 100 μl de 0,015 mg/ml buprenorfina, subcutânea, para o tratamento da dor.
   NOTA: Este protocolo de injeção pode ser aplicado a qualquer cepa de camundongos femininos ou masculinos em qualquer idade, usando as linhas celulares apropriadas para alterações na cepa.
2. Prepare as células tumorais para injeção com base em protocolos para a linha celular ou explantação tumoral de escolha. Teste todas as linhas de células tumorais antes da administração para a presença de patógenos murinas para reduzir o risco de introduzir tais patógenos na colônia animal.
   1. Para as células tumorais sinagenic Balb/c, incluindo células tumorais D2A1, D2.OR e 4T1, descongelam as células em uma placa de cultura tecidual de 10 cm 3 dias antes da injeção, de tal forma que as células do dia seguinte estejam em ~ 90 - 100% de confluência.
   2. 1 dia após o degelo das células tumorais uma vez com 1x de salina tamponada de fosfato (PBS) e trypsinize as células tumorais confluentes usando 2 ml de trippsina de 0,05% a 37 °C por 5 min. Adicione 8 ml de mídia completa (DMEM alta glicose, 10% soro bovino fetal, 2 mM L-glutamina e 1x penicilina/estreptomicina) e passagem 1:10 em um prato fresco de 10 cm com 10 ml de mídia completa.
   3. No dia das injeções, lave as células uma vez com 1x PBS e tentepsinizar conforme descrito acima.
   4. Resuspend células experimentadas em 8 ml de mídia completa, gire por 5 min a 1.500 x g, remova a mídia e resuspende em 5 ml 1x PBS.
   5. Conte células em um hemócito usando exclusão azul trypan para avaliação de viabilidade. Células resuspend para injeção em 1x PBS em uma concentração e volume pré-determinados.
      NOTA: Recomenda-se 5 a 10 μl, pois volumes menores de injeção evitam danos desnecessários ao fígado.
   6. Mantenha as células no gelo durante as injeções. Após a conclusão das injeções, devolva uma amostra de células ao laboratório e coloque em cultura em mídia completa por 1 dia para garantir a viabilidade.
3. Coloque o rato sob anestesia com 2 - 2,5% de isoflurano (2-cloro-2-(difluorometoxy)-1,1,1-trifluoro-etano) fornecido em oxigênio. Mantenha a temperatura corporal usando a almofada de aquecimento.  Certifique-se de anestesia completa avaliando uma reação a uma pitada de dedo do dedo do dedo e, em seguida, manter a anestesia em 2 - 2,5% de isoflurane.
   NOTA: É importante monitorar a taxa de respiração dos animais e ajustar a taxa de fluxo isoflurane de acordo com todo o procedimento.
4. Coloque uma pequena quantidade de lágrimas artificiais ou pomada veterinária sobre cada olho para evitar a secagem excessiva dos olhos durante o procedimento cirúrgico.
5. Coloque o mouse em uma posição supina, em suas costas com o abdômen exposto.
6. Remova o cabelo no lado esquerdo ventral do roedor do espaço da segunda costela até o 4º mamilo da glândula mamária inguinal, limpando a área com depilatório químico. Deixe que o depilatório se sente por 1 - 2 min e depois remova completamente com gaze e H2O. Esta etapa pode ser feita com 1 a 2 dias de antecedência para economizar tempo se inúmeras cirurgias forem planejadas.
7. Pegue uma esponja de gaze estéril de 2 x 2" (encharcada em 2% de clorexidina) e limpe o mouse no local da depilação. Esterilize toda a área circundante, incluindo a cauda, para minimizar a contaminação bacteriana dos instrumentos.
8. Limpe o local da depilação e área circundante para baixo com uma almofada de preparação para álcool.
9. Repita 2% de clorhexidina e álcool passos mais uma vez e finalize com uma limpeza de clorexidina final para um total de três 2% de clorexidina e duas lavagens de almofada de preparação de álcool. Faça a limpeza final da Clorexidina de tal forma que o produto químico não esteja pingando ao redor do local cirúrgico para evitar a clorexidina em órgãos internos.
   NOTA: A aplicação de grandes quantidades de clorexidina e álcool na pele e pelos circundantes pode resultar em uma queda significativa na temperatura corporal. Não limpe com volume excessivo durante as etapas 2.7-2.9. Mantenha a temperatura corporal com uma almofada de aquecimento.
10. Usando luvas estéreis e um bisturi esterilizado com lâmina estéril, faça uma única incisão de 1 polegada na pele entre os planos mediano e sagital do lado esquerdo do mouse, começando logo abaixo das costelas e terminando logo acima do plano da quarta de glândula mamária inguinal.
11. Usando tesouras e fórceps esterilizados autoclaved ou contas, faça uma incisão semelhante de 1 polegada no peritônio. Evite cortar a almofada de gordura mamária e certifique-se de não cortar os intestinos, fígado ou diafragma.
12. Coloque uma almofada de gaze de 4 x 4" encharcada em soro fisiológico estéril no lado esquerdo do mouse, onde a incisão foi feita, de tal forma que órgãos internos possam ser colocados na gaze e não entrar em contato com a pele circundante ou área cirúrgica.
13. Prepare as células tumorais pipetting para cima e para baixo várias vezes, pois as células tumorais se instalam durante a preparação do camundongo. Prepare uma seringa de agulha removível de 25 μl e agulha de calibre 32 com células tumorais. Empurre a seringa até que as células tumorais estejam na ponta da agulha e o êmbolo esteja no volume apropriado para injeção; evite a injeção de bolhas de ar.
14. Limpe o lado de fora da agulha com uma almofada de álcool estéril para remover quaisquer células tumorais externas. Tenha cuidado para evitar agulhas.
15. Segure o lado mediano da incisão, incluindo a pele e o revestimento peritoneal, de lado com os fórceps e use um cotonete estéril para puxar cuidadosamente os intestinos grosso e pequeno para fora, colocando-os sobre a gaze estéril encharcada em soro fisiológico estéril. Puxe intestinos grandes e pequenos até que a veia portal seja visualizada.
16. Cubra os órgãos internos na gaze salina encharcada para manter a umidade interna e a esterilidade.
17. Tenha um assistente, também usando luvas estéreis, segure os intestinos envoltos na gaze salina encharcada suavemente fora do caminho com um cotonete de algodão estéril para revelar completamente a veia portal. Além disso, pode ser necessário usar o hemostat ou fórceps autoclavados para manter o tecido de lado no lado mediano da incisão.
18. Insira a agulha carregada com células tumorais ~ 3 - 5 mm na veia portal ~ 10 mm abaixo do fígado em um ângulo < 5° para a veia, com chanfrado voltado para cima. Injete lentamente o volume total contendo células tumorais. Deixe o sangue passar pela cabeça da agulha por vários segundos para evitar o fluxo de volta das células tumorais para fora da veia. Minimize o movimento da agulha na veia durante a injeção. Novamente, tenha cuidado para evitar agulhas.
    NOTA: A visualização da veia do portal é feita sem ampliação, porém um microscópio estéreo pode ser usado se preferir.
19. Remova a agulha ao mesmo tempo colocando um aplicador de ponta de algodão estéril na veia com pressão. Com o assistente ainda segurando os intestinos de lado coloque um pedaço de 0,5 - 1 cm2 gaze hemostática sobre o local da injeção na veia.
    NOTA: O pó hemostático também foi tentado para esta etapa no protocolo, mas não foi eficaz em parar a perda de sangue venoso após a injeção.
20. Segure a gaze hemostática no local da injeção com pressão de um aplicador de ponta de algodão estéril por 5 minutos.
21. Avalie o fechamento da veia levantando cuidadosamente a gaze hemostática, se a gaze grudar no tecido circundante, uma pequena quantidade de soro fisiológico estéril pode ser usada para absorver e levantar a gaze.
22. Se a perda de sangue ocorrer neste momento, coloque um pedaço adicional de gaze hemostática no local com pressão por mais 5 minutos. Quando o fluxo sanguíneo parar completamente, remova a gaze do rato.
    NOTA: A perda de sangue durante o procedimento cirúrgico deve ser cuidadosamente avaliada e se o volume total permitido de perda de sangue for atendido ou excedido (com base em procedimentos operacionais padrão regulatórios para os conselhos de revisão institucionais do investigador), o camundongo deve ser eutanizado enquanto sob anestesia por perfusão cardíaca.
23. Uma vez que o local da injeção seja considerado intacto, sem sangue saindo do local da injeção, coloque os órgãos internos suavemente de volta à cavidade abdominal.
24. Sutura o revestimento peritoneal e, em seguida, a pele com sutura vicríl estéril 4-0 e agulha de taper usando um simples padrão de sutura contínua ou interrompida. Normalmente, fechar a incisão requer 10-15 suturas.
25. Injete 100 μl de bupivacaína (5 mg/ml) ao longo do local de incisão para o manejo local da dor usando uma seringa de insulina. Injete 0,5 ml de soro fisiológico estéril subcutâneamente usando uma seringa de 1 ml com agulha de calibre 26 para hidratação. As cirurgias demoram de 15 a 25 minutos para serem concluídas.
26. Para manter as condições estéreis durante toda a cirurgia, certifique-se de que todas as ferramentas e materiais que entram em contato com o rato, incluindo as mãos enluvadas, sejam limpos adequadamente antes do contato. Sempre que possível, use materiais e luvas estéreis, ou utilize minimamente uma solução de 70% de etanol ou 10% solução de alvejante para limpar.
27. Se várias cirurgias forem planejadas para uma única sessão, refaça a área cirúrgica inicial com cortina estéril fresca, seringas de insulina, seringas de 1 ml, soro fisiológico estéril, esponjas de gaze estéril de 2 x 2", gaze estéril de 4 x 4", gaze hemostática cortada em 0,5 - 1 cm2 peças, suturas vicríl 4-0 com agulha de fita adesiva, e 2% cloroxidina. Esterilizar a tesoura, fórceps e hemostat entre as cirurgias e permitir esfriar adequadamente antes de reutilizar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml Syringe w/ 26-gauge Needle	BD Syringe	309597	309597
Alcohol Prep Pads	Fisher Scientific	06-669-62	For cleaning of abdomen prior to surgical incision
All Purpose Sponges, Sterile	Kendall	8044	4" x 4", use dipped in sterile saline to keep large and small intestines protected and hydrated during surgery
Artificial Tears	Rugby	370114	Mineral oil 15%, white petrolatum 83%; use to protect eyes during surgery
Buprenorphine HCl, 0.3 mg/ml	Mfg. by Reckitt Benckiser	NDC-12496-0757-1	Use at 0.05 - 0.1 mg/kg body weight, 1 - 2x daily for 72 hr, injected subcutaneously
Bupivacaine HCl, 0.5% (5 mg/ml)	Mfg. by Humira Inc	NDC-04091163-01	Use at 0.5%, 1x immediately after surgery, 10 μl injected subcutaneously at incision site
Celox™ Rapid Hemostatic Gauze	Medtrade Products Ltd.	FG08839011	Cut into 5 mm² pieces, use to stop blood flow out of the portal vein with pressure following injection
Chlorhexidine, 2% Solution	Vet One	1CHL008	Use caution, do not get chlorhexidine in mucous membranes or ears of the mouse
Cotton Tipped Applicators, Sterile	Fisher Scientific	23-400-114	6" Wooden Shaft 2 pc/envelope
DMEM, High-Glucose	HyClone	SH30243.01	Cell culture media base for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines
Dry Glass Bead Sterilizer			Use between surgeries to sterilize stainless steel tools, use caution, extremely hot; multiple suppliers
Ethanol, 70% solution			Use caution flammable; use to clean surgical area as needed; multiple suppliers
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH30071.03	Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 Journal of Visualized Experiments www.jove.com Copyright © 2016 Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Unported License Page 2 of 3 mammary tumor cell lines, use at 10% in DMEM high glucose
Gauze, Sterile	Kendall	2146	2" x 2", use dipped in chlorhexidine 2% solution for cleaning of abdomen prior to surgical incision
Isoflurane	Piramal	NDC-66794-017-25	Administered at 2.5%
Isoflurane Vaporizer	VetEquip	911103	Use caution, vaporizes anesthetic gases
Removable Needle Syringe, 25 μl, Model 1702	Hamilton	7654-01	For portal vein injection; use caution, paricularly while working with tumor cell-loaded needles, sharp when needle is attached
Scalpel handle			Stainless steel; multiple suppliers
Scalpel blade, #15			Carbon steel, sterile, size 15; multiple suppliers
Small Hub Removable Needles, 32-gauge	Hamilton	7803-04	For portal vein injection, 1" length, point style 4, 12° angle, 33- to 34- gauge reusable needles can also be used; use caution, paricularly while working with tumor cell loaded needles, sharp
Sterile Saline	Fisher Scientific	BP358-212	0.9% NaCl solution; alternatively, can be homemade and sterile filtered
Surgical Gloves, Sterile			Multiple suppliers
Sutures, Sterile	Ethicon	J310H	4-0 27" coated vicryl w/ 22 mm 1/2c taper ethalloy needle; use caution, sharp
Table Top Portable Anesthesia Machine	VetEquip	901801	Use with isoflurane vaporizer for mouse anesthesia
Thumb Dressing Forceps			Stainless steel, serrated, blunted; multiple suppliers
Towel Drapes, Sterile	Dynarex	4410	18" x 26", to cover heating pad and provide a sterile workspace during surgery