Portal Veneninjektion: Eine Methode zur Untersuchung der Krebsmetastasierung der Leber

Overview

Dieses Video beschreibt ein chirurgisches Verfahren, um Brusttumorzellen über eine Portalveneninjektion an die murine Leber zu liefern. Dieses Modell ermöglicht die Untersuchung von späten Stadien der Lebermetastasierung.

Protocol

1. Vorbereitung des Operationsbereichs und der Instrumente

1. Bereiten Sie die Schere, Zange und Hämostat durch Autoklavieren bei 124 °C für 30 min, 1 - 2 Tage vor den geplanten Operationen. Sorgen Sie für den Zugang zu autoklavierten oder sterilen Bettwäsche, Käfigen und Lebensmitteln für die nachchirurgische Genesung.
2. Bereiten Sie einen aseptischen Operationsbereich vor, vorzugsweise in einer laminaren Strömungshaube.
   1. Wischen Sie alle Oberflächen des Operationsbereichs mit 10% Bleichmittel ab, einschließlich Heizkissen, Lichtquelle, Anästhesieschläuche und Nasenkegel, und jeden anderen Teil der chirurgischen Suite, der sich in unmittelbarer Nähe zum chirurgischen Eingriff befindet, während es durchgeführt wird.
   2. Legen Sie im aseptischen Operationsbereich das gereinigte Heizkissen mit sterilem Vorhang, Lichtquelle, Anästhesieschläuchen und Nosecon auf, Insulinspritzen, 1 ml Spritzen, Bupivacain, künstliche Tränen, sterile Kochsalzlösung, 2 x 2" sterile Gazeschwämme, 4 x 4" sterile Gaze, hämostatische Gaze in 0,5 - 1 cm2 Stück geschnitten, Schere, Zangen, Hämostat, 4-0 Vicryl-Nähte mit Kegelnadel und 50 ml 2% Chlorhexidingluconate in einem Autoklaven.
   3. Stellen Sie sicher, dass in diesem Raum Platz für vorbereitete Tumorzellen ist, die auf Eis gespeichert sind.
   4. Auf der Bank neben dem Operationsbereich, bereiten Sie den Erholungsbereich mit einem zweiten Heizkissen und reinigen Käfige mit steriler Bettwäsche.
      HINWEIS: In diesem Bereich können auch Gegenstände wie ein Perlensterilisator untergebracht werden.

2. Portal Veneninjektion

1. Eine Stunde vor den geplanten Injektionen behandeln Sie weibliche Balb/c-Mäuse im Alter von 8 - 15 Wochen mit 100 l 0,015 mg/ml Buprenorphin, subkutan, zur Schmerztherapie.
   HINWEIS: Dieses Injektionsprotokoll kann auf jeden Stamm der weiblichen oder männlichen Maus in jedem Alter angewendet werden, mit den entsprechenden Zelllinien für Veränderungen der Belastung.
2. Bereiten Sie die Tumorzellen auf der Grundlage von Protokollen für die Zelllinie oder Tumorexplantation ihrer Wahl auf die Injektion vor. Testen Sie alle Tumorzelllinien vor der Verabreichung auf das Vorhandensein von murinen Krankheitserregern, um das Risiko der Einschleppung solcher Krankheitserreger in die Tierkolonie zu reduzieren.
   1. Bei syngenischen Balb/c-Tumorzelllinien, einschließlich D2A1, D2.OR und 4T1 Tumorzellen, tauen Zellen 3 Tage vor der Injektion in eine 10 cm Gewebekulturplatte auf, so dass die Zellen am nächsten Tag bei einer Konfluenz von 90 - 100 % liegen.
   2. 1 Tag nach Tumorzelle auftauen Waschzellen einmal mit 1x Phosphat gepufferte Saline (PBS) und trypsinisieren die konfluenten Tumorzellen mit 2 ml 0,05% Trypsin bei 37 °C für 5 min. Fügen Sie 8 ml komplette Sendemittel (DMEM hohe Glukose, 10% fetales Rinderserum, 2 mM L-Glutamin und 1x Penicillin/Streptomycin) und Durchgang 1:10 in eine frische 10 cm Schale mit 10 ml Komplettemedien.
   3. Am Tag der Injektionen, waschen Zellen einmal mit 1x PBS und Trypsinize wie oben beschrieben.
   4. Trypsinisierte Zellen in 8 ml Komplettmedien resuspendieren, 5 min bei 1.500 x g drehen, die Medien entfernen und in 5 ml 1x PBS wieder aufsuspendieren.
   5. Zählen Sie Zellen auf einem Hämozytometer mit Trypanblau-Ausschluss für die Beurteilung der Lebensfähigkeit. Zellen zur Injektion in 1x PBS mit einer vorgegebenen Konzentration und Volumen resuspendieren.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, dass kleinere Injektionsvolumina unnötige Schäden an der Leber verhindern.
   6. Halten Sie die Zellen für die Dauer der Injektionen auf Eis. Nach Abschluss der Injektionen, geben Sie eine Probe von Zellen in das Labor und in Kultur in vollständigen Medien für 1 Tag, um die Lebensfähigkeit zu gewährleisten.
3. Stellen Sie die Maus unter Anästhesie mit 2 - 2,5% Isofluran (2-Chlor-2-(Difluormethoxy)-1,1,1-Trifluor-Ethan) in Sauerstoff. Halten Sie die Körpertemperatur mit dem Heizkissen aufrecht.  Sicherstellen einer vollständigen Anästhesie durch Bewertung einer Reaktion auf eine Zehenklemme, und halten Sie dann die Anästhesie bei 2 - 2,5% Isofluran.
   HINWEIS: Es ist wichtig, die Atemfrequenz der Tiere zu überwachen und die Isofluran-Durchflussrate während des gesamten Verfahrens entsprechend anzupassen.
4. Legen Sie eine kleine Menge künstlicher Tränen oder Tierarztsalbe über jedes Auge, um übermäßiges Trocknen der Augen während des chirurgischen Eingriffs zu vermeiden.
5. Legen Sie die Maus in eine Supine-Position, auf dem Rücken mit Abdomen ausgesetzt.
6. Entfernen Sie das Haar auf der ventralen linken Seite des Nagetiers vom zweiten Rippenraum bis zur 4. Leistenbrust, indem Sie den Bereich mit chemischem Enthaarungsmittel abwischen. Lassen Sie das Enthaarungsmittel für 1 - 2 min sitzen und dann vollständig mit Gaze und H2O entfernen. Dieser Schritt kann 1 - 2 Tage im Voraus durchgeführt werden, um Zeit zu sparen, wenn zahlreiche Operationen geplant sind.
7. Nehmen Sie einen 2 x 2" sterilen Gazeschwamm (getränkt in 2% Chlorhexidin) und wischen Sie die Maus an der Stelle der Haarentfernung ab. Sterilisieren Sie die gesamte Umgebung, einschließlich des Schwanzes, um die bakterielle Kontamination von Instrumenten zu minimieren.
8. Wischen Sie die Stelle der Haarentfernung und Umgebung mit einem Alkohol-Prep-Pad nach unten.
9. Wiederholen Sie 2% Chlorhexidin und Alkohol Schritte noch einmal und beenden sie mit einem abschließenden Chlorhexidin-Abwischen für insgesamt drei 2% Chlorhexidin und zwei Alkohol-Prep-Pad-Washes. Machen Sie das endgültige Chlorhexidin-Wischso, dass die Chemikalie nicht um die chirurgische Stelle tropft, um chlorhexidine auf den inneren Organen zu vermeiden.
   HINWEIS: Die Anwendung großer Mengen chlorhexidin und Alkohol auf die Haut und das umliegende Fell kann zu einem signifikanten Rückgang der Körpertemperatur führen. Wischen Sie nicht mit überschüssigem Volumen während der Schritte 2.7-2.9. Halten Sie die Körpertemperatur mit einem Heizkissen aufrecht.
10. Mit sterilen Handschuhen und einem sterilisierten Skalpell mit steriler Klinge, machen Sie einen einzigen 1-Zoll-Einschnitt in die Haut zwischen der medianen und sagittalen Ebenen auf der linken Seite der Maus, beginnend direkt unter den Rippen und endet knapp über der Ebene der vierten Leistenbrust Drüse Zitzen.
11. Mit autoklavierten oder Perlen sterilisierten Schere und Zange, machen Sie einen ähnlichen 1-Zoll-Einschnitt in das Peritoneum. Vermeiden Sie das Schneiden in das Brustfettpad und stellen Sie sicher, dass Sie den Darm, die Leber oder das Zwerchfell nicht schneiden.
12. Legen Sie ein 4 x 4" Gazepad in steriler Strandlinie auf der linken Seite der Maus getränkt, wo der Schnitt gemacht wurde, so dass innere Organe auf die Gaze gelegt werden können und nicht in Kontakt mit der umgebenden Haut oder chirurgischen Bereich kommen.
13. Bereiten Sie Tumorzellen vor, indem Sie mehrmals nach oben und unten pfeifen, da sich Tumorzellen während der Vorbereitung der Maus absetzen. Bereiten Sie eine abnehmbare Nadelspritze mit 25 l und eine 32-Spur-Nadel mit Tumorzellen vor. Drücken Sie die Spritze, bis sich tumorzellen an der Spitze der Nadel befinden und der Kolben das entsprechende Injektionsvolumen hat; Injektion von Luftblasen zu vermeiden.
14. Wischen Sie die Außenseite der Nadel mit einem sterilen Alkoholpad ab, um externe Tumorzellen zu entfernen. Seien Sie vorsichtig, um Nadelstiche zu vermeiden.
15. Halten Sie die mediane Seite des Schnittes, einschließlich Haut und Peritonealfutter, beiseite mit der Zange und verwenden Sie einen sterilen Wattestäbchen, um den großen und kleinen Darm vorsichtig herauszuziehen, indem Sie sie auf die sterile Gaze in steriler Saline getränkt. Ziehen Sie große und kleine Darm, bis die Portalvene visualisiert ist.
16. Bedecken Sie die inneren Organe in der saline getränkten Gaze, um innere Feuchtigkeit und Sterilität zu erhalten.
17. Lassen Sie einen Assistenten, der auch sterile Handschuhe trägt, den in der saline getränkten Gaze eingewickelten Darm sanft aus dem Weg mit einem sterilen Wattestäbchen mit Watte halten, um die Portalvene vollständig zu enthüllen. Zusätzlich kann es notwendig sein, das autoklavierte Hämostat oder Zange zu verwenden, um Gewebe beiseite auf der medianen Seite des Schnittes zu halten.
18. Legen Sie die mit Tumorzellen beladene Nadel mit einer Ader von 3 - 5 mm in die Portalvene 10 mm unterhalb der Leber in einem Winkel < 5° zur Vene ein, wobei die Abschrägung nach oben gerichtet ist. Injizieren Sie langsam das volle Volumen, das Tumorzellen enthält. Lassen Sie Das Blut für einige Sekunden am Nadelkopf vorbeifließen, um den Rückfluss von Tumorzellen aus der Vene zu vermeiden. Minimieren Sie das Bewegen der Nadel in der Vene während der Injektion. Auch hier sollten Sie Vorsicht walten lassen, um Nadelstiche zu vermeiden.
    HINWEIS: Die Visualisierung der Portalvene erfolgt ohne Vergrößerung, bei Bedarf kann jedoch ein Stereomikroskop verwendet werden.
19. Entfernen Sie die Nadel und legen Sie gleichzeitig einen sterilen Baumwollspitzenapplikator mit Druck auf die Vene. Mit dem Assistenten noch halten den Darm beiseite legen Sie ein Stück von 0,5 - 1 cm2 hämostatische Gaze über die Injektionsstelle auf der Vene.
    HINWEIS: Hämostatisches Pulver wurde auch für diesen Schritt im Protokoll versucht, war aber nicht wirksam bei der Beendigung venösen Blutverlust nach der Injektion.
20. Halten Sie die hämostatische Gaze an der Injektionsstelle mit Druck von einem sterilen Baumwollspitzenapplikator für 5 min.
21. Beurteilen Sie den Verschluss der Vene, indem Sie die hämostatische Gaze sorgfältig anheben, wenn die Gaze am umgebenden Gewebe klebt, kann eine kleine Menge steriler Saline verwendet werden, um die Gaze einzuweichen und zu heben.
22. Wenn zu diesem Zeitpunkt ein Blutverlust auftritt, legen Sie ein zusätzliches Stück hämostatische Gaze mit Druck für weitere 5 min an der Stelle. Wenn der Blutfluss vollständig eingestellt ist, entfernen Sie die Gaze von der Maus.
    HINWEIS: Der Blutverlust während des chirurgischen Eingriffs muss sorgfältig bewertet werden, und wenn das zulässige Blutverlustvolumen des zulässigen Gesamtschadens erreicht oder überschritten wird (basierend auf den regulatorischen Standard-Betriebsverfahren für die institutionellen Prüfungsausschüsse des Prüfers), muss die Maus unter Narkose durch Herzperfusion eingeschläfert werden.
23. Sobald die Injektionsstelle als intakt gilt, ohne Dassblut die Injektionsstelle verlässt, legen Sie die inneren Organe sanft zurück in die Bauchhöhle.
24. Säen Sie die Peritoneal-Futter und dann die Haut mit sterilen 4-0 Vicryl Naht und Verjüngungsnadel mit einem einfachen kontinuierlichen oder unterbrochenen Nahtmuster. In der Regel erfordert das Schließen des Schnittes 10-15 Nähte.
25. Injizieren Sie 100 l Bupivacain (5 mg/ml) entlang der Einschnittstelle für das lokale Schmerzmanagement mit einer Insulinspritze. Mit einer 1 ml Spritze mit 26-Spur-Nadel zur Hydratation 0,5 ml sterile Saline subkutan injizieren. Operationen dauern 15 - 25 min.
26. Um die sterilen Bedingungen während der gesamten Operation aufrechtzuerhalten, stellen Sie sicher, dass alle Werkzeuge und Materialien, die mit der Maus in Berührung kommen, einschließlich der Handhände, vor dem Kontakt angemessen gereinigt werden. Verwenden Sie nach Möglichkeit sterile Materialien und Handschuhe oder verwenden Sie minimal eine 70% Ethanollösung oder 10% Bleichlösung zu reinigen.
27. Wenn mehrere Operationen für eine einzige Sitzung geplant sind, stellen Sie den anfänglichen operationsreichen Bereich mit frischem sterilem Drap, Insulinspritzen, 1 ml Spritzen, steriler Salzsäure, 2 x 2" sterilen Gazeschwämmen, 4 x 4" steriler Gaze, hämostatischer Gaze in 0,5 - 1 cm2 Stück, 4-0 Vierfachnähte mit Tapernadel und 2% Chlorhexidin um. Perlen sterilisieren die Schere, Zange, und Hämostat zwischen den Operationen und lassen Sie vor der Wiederverwendung ausreichend abkühlen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml Syringe w/ 26-gauge Needle	BD Syringe	309597	309597
Alcohol Prep Pads	Fisher Scientific	06-669-62	For cleaning of abdomen prior to surgical incision
All Purpose Sponges, Sterile	Kendall	8044	4" x 4", use dipped in sterile saline to keep large and small intestines protected and hydrated during surgery
Artificial Tears	Rugby	370114	Mineral oil 15%, white petrolatum 83%; use to protect eyes during surgery
Buprenorphine HCl, 0.3 mg/ml	Mfg. by Reckitt Benckiser	NDC-12496-0757-1	Use at 0.05 - 0.1 mg/kg body weight, 1 - 2x daily for 72 hr, injected subcutaneously
Bupivacaine HCl, 0.5% (5 mg/ml)	Mfg. by Humira Inc	NDC-04091163-01	Use at 0.5%, 1x immediately after surgery, 10 μl injected subcutaneously at incision site
Celox™ Rapid Hemostatic Gauze	Medtrade Products Ltd.	FG08839011	Cut into 5 mm² pieces, use to stop blood flow out of the portal vein with pressure following injection
Chlorhexidine, 2% Solution	Vet One	1CHL008	Use caution, do not get chlorhexidine in mucous membranes or ears of the mouse
Cotton Tipped Applicators, Sterile	Fisher Scientific	23-400-114	6" Wooden Shaft 2 pc/envelope
DMEM, High-Glucose	HyClone	SH30243.01	Cell culture media base for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines
Dry Glass Bead Sterilizer			Use between surgeries to sterilize stainless steel tools, use caution, extremely hot; multiple suppliers
Ethanol, 70% solution			Use caution flammable; use to clean surgical area as needed; multiple suppliers
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH30071.03	Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 Journal of Visualized Experiments www.jove.com Copyright © 2016 Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Unported License Page 2 of 3 mammary tumor cell lines, use at 10% in DMEM high glucose
Gauze, Sterile	Kendall	2146	2" x 2", use dipped in chlorhexidine 2% solution for cleaning of abdomen prior to surgical incision
Isoflurane	Piramal	NDC-66794-017-25	Administered at 2.5%
Isoflurane Vaporizer	VetEquip	911103	Use caution, vaporizes anesthetic gases
Removable Needle Syringe, 25 μl, Model 1702	Hamilton	7654-01	For portal vein injection; use caution, paricularly while working with tumor cell-loaded needles, sharp when needle is attached
Scalpel handle			Stainless steel; multiple suppliers
Scalpel blade, #15			Carbon steel, sterile, size 15; multiple suppliers
Small Hub Removable Needles, 32-gauge	Hamilton	7803-04	For portal vein injection, 1" length, point style 4, 12° angle, 33- to 34- gauge reusable needles can also be used; use caution, paricularly while working with tumor cell loaded needles, sharp
Sterile Saline	Fisher Scientific	BP358-212	0.9% NaCl solution; alternatively, can be homemade and sterile filtered
Surgical Gloves, Sterile			Multiple suppliers
Sutures, Sterile	Ethicon	J310H	4-0 27" coated vicryl w/ 22 mm 1/2c taper ethalloy needle; use caution, sharp
Table Top Portable Anesthesia Machine	VetEquip	901801	Use with isoflurane vaporizer for mouse anesthesia
Thumb Dressing Forceps			Stainless steel, serrated, blunted; multiple suppliers
Towel Drapes, Sterile	Dynarex	4410	18" x 26", to cover heating pad and provide a sterile workspace during surgery