Одиночных молекул изображений ядерного транспорта

Summary

Одноместный микроскопии молекулы approch условии романа понимание ядерной транспорта.

Abstract

Полезность флуоресценции одной молекулы подходы микроскопии было доказано, что большого воспользоваться в понимании биологических реакций в течение последнего десятилетия. Исследование молекулярных взаимодействий с высоким временным и пространственным разрешением глубоко внутри клетки остается сложной из-за изначально слабые сигналы, связанные с отдельными молекулами. Последние работы Ян и соавт. показали, что узкие поля epifluorescence микроскопия позволяет визуализировать nucleocytoplasmic транспорта на одном уровне молекулы. По единого подхода молекулы, важно кинетики, таких, как ядерное время транспортировки и эффективности, для сигнала-зависимые и независимые молекулы груза были получены. Здесь мы описали протокол для методологический подход с улучшенной пространственно-временной разрешение 0,4 мс и 12 нм. Улучшенное разрешение дало нам возможность захвата переходных активного транспорта и пассивной диффузии через события ядерные комплексы поры (NPC) в полу-неповрежденных клетках. Мы ожидаем, что этот метод будет использоваться для выяснения других обязательных и торговли событиях внутри клеток.

Protocol

1. Подготовка клеточной системы для одного эксперимента молекула

1. По крайней мере за неделю до начала, начать новую культуру клеточной линии HeLa из фонда по оттаивания при 37 ° С и положить в 25 см ² культуру колбу с 5 мл СМИ, Инкубируйте клетки при 37 ° С в течение 5% CO ₂ инкубаторе в течение 24 часов и разделить его по крайней мере 3 раза, чтобы обеспечить оптимальные условия для клеток. Однако клетки не должна быть разделена более чем в 20 раз из-за склонности их темпы роста замедляться значительно. HeLa клетки ранее генной инженерии, чтобы GFP (зеленый флуоресцентный белок), слитый с ядерной оболочки пор мембраны белок POM 121. Это необходимо для точной локализации ядерной оболочки.
2. За день до эксперимента, клетки предназначены для одного эксперимента молекула должна быть распространена на автоклавного скольжения крышки помещен в стерильную чашку Петри. Покровное должно быть приостановлено в DMEM (среда Дульбекко изменение Орла, Гранд-Айленд, Нью-Йорк) с добавлением 4,5 г / л глюкозы, 862 мг / л GlutaMAX-я, 15 мг / мл фенола красного, 100 ед / мл пенициллина, 100μg/mL стрептомицину и 10% новорожденных телячьей сыворотки. Объем культура должна быть 1 мл на покровное стекло, равномерно распределенные по всей поверхности. Эти чашки Петри с крышкой скользит затем помещаются в инкубатор CO ₂ и выдерживают в течение 24 часов до эксперимента. Для того, чтобы культура клеток, чтобы служить для одного эксперимента молекула клетка слияния на покровное стекло не должно превышать 70%, чтобы обеспечить хороший свободы для мытья буферов и белков интереса проходит ядерной транспорта.
3. В день эксперимента, поток-камеры были построены, добавив верхнюю крышку скольжения вместе с двумя линиями силиконовой смазки как распорки. Очень важно, чтобы убедиться, что клетки не высыхают в процессе подготовки. Мы обычно предпочитают иметь две камеры, сделанные на одной покровным стеклом, чтобы два разных условия для эксперимента. Верхняя крышка скользит небольшие осколки стекла покровное стекло режется ножом алмазов составит около 6мм2 были поставлены с ног на голову на Kimwipe. Две линии силиконовой смазки было мелко, расположенных вдоль его края крышки скользит с 10 мл пластиковый шприц, который пипетки плотно прикреплена с парафильмом контролировать размер смазки шарика.
4. HeLa-клеток покрытием слайд тогда капельного высушенные и смонтированы с жиром, как клей в домашних обрабатываемых алюминиевая рама - характер, который служил для хранения слайдов в держателе образца микроскопом.
5. Верхней скользит крышка с двумя линиями жир затем взял с острым пинцетом, а затем перевернутый по ячейке покрытием слайд, образуя поток камеры. Относительно твердой приверженности было сделано путем нажатия мягко по смазаны края покровного стекла.
6. Так как мы сделали два отдельных камер на одной ячейке покрытием слайд важно обеспечить хорошее уплотнение, чтобы предотвратить перекрестное заражение. С этой целью несколько строк силиконовой смазки были применены в между камерами от верхней к нижней части слайда, чтобы запечатать друг от друга. Несколько линий смазки были также поставить на внешние стороны камеры.
7. DMEM СМИ был добавлен в проточную камеру, чтобы предотвратить клетки от высыхания. Решение поток способствовал небольшой кусочек фильтровальной бумаги поглощать жидкость из выхода сторону потока камер. С твердой рукой, раствор можно добавить одновременно микропипетки по одну сторону от потока-камера с одной стороны, и поглощается с другой бок о фильтровальную бумагу.
8. После строительства, в нижней части слайда промывали смоченный хлопка наконечником тампоном, в два раза с водой, а затем два раза со 100% этанола.
9. Как только слайд устанавливается на микроскоп, клетки промывали 2 х 25 мкл буфера импорта (20 мМ HEPES, 110 мм KOAc, 5 мМ NaOAc, 2 мМ MgOAc, 1 мМ EGTA, рН 7,3). Затем клетки проницаемыми для ~ 2 минуты с 2 х 25 мкл 40 мкг / мл дигитонин в импорте буфера и снова промывают с 2 х 25 мкл буфера импорта (20 мМ HEPES, 110 мм KOAc, 5 мМ NaOAc, 2 мМ MgOAc, 1 мМ EGTA, рН 7.3) с добавлением 1,5% поливинилпирролидона (ПВП; 360 кДа). Это может быть необходимо для контроля пермеабилизации в реальном времени с помощью светлого поля. PVP был включен во все решения импорт буфера после дигитонин для предотвращения осмотическое набухание ядер. Нетронутым ядро, вместе с контролируемой средой цитоплазмы, обеспечивает значительно упростить транспортную систему, которая позволяет нам выяснить сложных ядерных шаг за шагом. Предыдущая ансамбля и отдельных молекул эксперименты, которые проводятся в системе обеспечили большие достижения в области ядерной транспорта.

2. Подготовка необходимых белков для ядерных экспериментов транспорта

1. С помощью обычных бактериальных преобразования специальные штаммы E.coli (JM109) были разработаны для того, чтобы гиперэкспрессией генов, ответственных запроизводство вышеуказанных белков интереса и хранятся на складе при температуре -80 ° C. (Для NLS-2xGFP мы использовали pTrcHisB вектор Invitrogen). Loopful или ~ 50 мкл замороженных запасов люминесцентных или груза клеток, экспрессирующих белок E. Coli передаются в 5 мл LB среды с добавлением 5 мкл ампициллина (U 1000) и вырос аэробно при встряхивании в течение ночи при 37 ° С при 225 оборотах в минуту.
2. После 24 часов 500 мкл насыщенного культуры переносят в 500 мл LB СМИ и встряхивают в 37 ° C инкубаторе в течение 5-6 часов после добавления 250 мкл IPTG (изопропиловый _-Д-1-thiogalactopyranoside) и инкубировали еще 5-6 часов. Это необходимо потому, IPTG является лактоза метаболит, который запускает транскрипцию оперона лак, где ген LacZ заменен ген интереса и IPTG затем используется, чтобы вызвать экспрессию генов.
3. Культура, то нити в охлаждении высокоскоростной центрифуге при 12000 оборотов в минуту в течение 15 минут и супернатант отбрасывается. Затем клетки ресуспендировали в 40 мл CelLytic B (B CelLytic результатов в быстрое и эффективное извлечение из белков, которые являются подходящими для очистки близости и анализа.) Объем должен быть основан на 10 мл на 1 г гранул. 28 мкл меркаптоэтанола добавляется разрыв дисульфидных связей и 400 мкл phenylmethanesulphonyl фторид отключить протеаз от переваривания белков интерес после лизиса клеток. "Протеазы коктейль" также добавили (400 мкл 0,2 мг / мл пепстатина А. 400 мкл 0,2 мг / мл leupeptin, 400 мкл 2 мг / мл ингибитор трипсина), чтобы гарантировать, что белковые экстракты не унижают достоинство перед проведением анализа для целей интересов. Затем мы добавляем 400 мкл 1М имидазола, используется для элюции меткой белки, которые связываются с ионами Ni прикреплен к поверхности из бисера в колоночной хроматографии и 1 мм ДНКазы I, используется для ухудшить нежелательных одно-и двухцепочечной ДНК в 5 phosphodinucleotide и олигонуклеотидных фрагменты.
4. Перемешать смесь в темных на льду в течение 30 минут, чтобы дать достаточно времени для реакции, спина при 10000 оборотов в минуту в течение 60 минут в охлаждающей центрифуге. Урожай супернатант и в рамках подготовки к хроматографии выполнять вливания с Ni-NTA (никель-нитрилотриуксусная кислота Superflow путем Qiagen), крутя в трубах микроцентрифужную центрифуг на максимальной скорости в течение 3 минут и промывки лизис буфера, повторяя прядения и мытье, пока смесь не от любых голубой оттенок. Перемешайте полученную смесь медленно в темном контейнере на льду в течение 60 минут.
5. Выполните колоночной хроматографии, протекающий через 12 фракций следующим образом. Первая фракция является течь через 10 мл надосадочной смешанного с Ni-NTA на предыдущем шаге. Вторая 10 мл лизирующего буфера (50 мМ Na-фосфат, 300 мМ NaCl, 20 мМ имидазол, рН 8,0), третье 10 мл буфера (10 мМ имидазол, 100 мМ NaCl, рН 8,0), четвертое и остальные 0,5 мл элюирующего буфера (250 мМ имидазола, 100 мМ NaCl, рН 8,0)
6. Подготовка SDS-PAGE полиакриламидном геле и подготовить наши образцы, смешивая 4 мкл фракции и 1 мкл 5X СО (300 мм Трис 6,8, 25% BME, 10% SDS, 50% глицерина). Для стандартного мы использовали 100 кб ДНК лестницы, по Invitrogen. Перед загрузкой сварили мы наших образцов в течение 5 минут. После загрузки мы побежали гель на 120 в течение 60 минут. Тогда мы с пятнами, обесцвечивают и, наконец, сушат в специальных сухих геля в течение 2 часов при 80C.
7. Затем мы рассматривали результаты на геле и расположен фракций, которые принесли наилучший результат. В зависимости от белков нашего интереса, полосы должны быть расположены, соответственно, размер белка. Эта доля должна быть выбрана для дальнейшей очистки белков с MonoQ и Superdex 200 (Amersham Pharmacia).
8. Концентрация осуществляется спиннинг наиболее концентрированном фракций в Nanosep фильтр с размером пор 10 тыс. на 14 оборотов в минуту в течение 5 минут, стиральные его элюции буфера каждый раз. Необходимо, чтобы определить конечную концентрацию белка использованием анализа BSA для дальнейшей процедуры маркировки белка.
9. Собственной флуоресценции зелень NLS-2xGFP не может быть использована для одного изображения молекулы ядерного транспорта из-за его плохой фото-стабильность и перекрывается спектром с клеточной флуоресценции. Таким образом, мы обозначаем грузов молекулы с избытком цистеин-реактивный органический краситель (Alexa555 или Alexa 647 малеимида из молекулярных проб) в течение 2 часов при комнатной температуре в 50 мМ фосфат натрия, 150 мМ NaCl после снижения с TCEP трис (2 - карбоксиэтил) в течение 20 минут. Реакции гасили 2-меркаптоэтанол и белковых растворов диализовали для удаления свободного красителя.

3. Одноместный микроскопии молекулы

1. Наш микроскоп создан включает Olympus IX81 оснащен 1,4 Н. А. 100x нефтью погружения цели (UPLSAPO 100XO, Olympus), 35 мВт 633 нм гелий-неонового лазера (Меллес Griot), ртутная лампа с GFP фильтр настроен, на Встроенный умножения получить прибор с зарядовой связью камера (Каскад 128 +, Roper Scientific) и йэлектронной Slidebook пакет программного обеспечения (Intelligent Инновации Imaging) для сбора и обработки данных. Оптический прерыватель (Newport) была использована для создания включения-выключения режима лазерного возбуждения. GFP и Alexa647 флуоресценции возбуждаются ртутной лампы и 633 нм лазер, соответственно. Зеленой и красной флуоресценции излучения была собрана и ту же цель, фильтруется дихроичных фильтра (Di01-R405/488/561/635-25x36, Semrock) и выбросов фильтр (NF01-405/488/561/635-25X5. 0, Semrock) и изображено идентичные ПЗС-камерой.
2. В единичных экспериментов молекулы, мы даем возможность флуоресценции фотообесцвечивания время одной молекулы груза будет дольше, чем время транспортировки. Чтобы определить, фотообесцвечивания время, 0,1 нМ молекул грузов высевали на стеклянную крышку скольжения и становятся неподвижными в течение 30 минут из-за неспецифических поглощения. Затем, время хода флуоресценции измерены. В зависимости от белка раз интерес photobleach будет отличаться в зависимости от числа cysteins способные реагировать с малеимидов, поэтому интенсивность освещения и подсветки области должны быть скорректированы, чтобы не вызвать предварительное фотообесцвечивания и убедиться, что груз молекул, меченных Alexa 647 дисплей флуоресценции дольше, чем грузов взаимодействовать с NPC.
3. Для импорта эксперименты в проницаемыми клеток, груза и необходимых кофакторов транспорта были добавлены вместе. Типичные реакции грузов импорт содержащихся 1 мМ ГТФ, 0,5 мкМ Importin-, 0,5 мкМ Importin-1, 2 мкМ Ran и 1 мкМ NTF2 для облегченного транспорта и 0,1 нМ 10KDa Декстран для пассивного транспорта .. Флуоресцентные концентрации грузов> 100 нм в натуральном экспериментов и ~ 100 мкм для одного анализов молекулы. При этих концентрациях,> 99% грузов, как ожидается, образуют комплексы с Importin и Importin. Транспорт скорость контролировалась epifluorescence (если только относительные показатели были важны) или конфокальной флуоресцентной микроскопии (если абсолютных скоростей были востребованы).
4. Первое положение ядерной оболочки определялась широким полем epifluorescence микроскопии с привлечением HBO ртутная лампа с набором фильтров для GFP сфотографировать NE. Интенсивности пикселов в строке или столбце примерно перпендикулярно к северо-востоку были пригодны с гауссовым. Пиков гауссовой для определенного набора интенсивности пикселов считался Н. положение для этой строки и столбца. Пик позиций серии таких Гаусса были затем согласуется с полиномом второй степени, уступая путь Н. Е. течение всего изображения.
5. Как только Н. локализован, важно, чтобы избавиться от всех аутофлюоресценция использованием 633 нм гелий-неонового лазера, пока он полностью photobleached, как правило, в течение 60 секунд вполне достаточно.
6. Пример молекулы должны быть оставлены в 1,5% растворе ПВП и смесь добавляется в проточную камеру в объеме 25 л, а затем тащили через камеру применения фитиль фильтровальную бумагу. Полное следует позаботиться при добавлении белков импортных грузов в проницаемыми клетки сразу после ядерной локализации конверт с фокус может быть легко нарушен какой-либо энергичные движения.
7. Как только груз молекулы добавляются, 633 нм, гелий-неонового лазера был использован для освещения транспортных траектории транзитом молекул. Оптический прерыватель (Newport) должны заниматься примерно 5 Гц, чтобы избежать фотообесцвечивания из-за высокой удельной мощности лазера, а также позволяют новую порцию без photobleached одиночные молекулы подойти к северо-восток. Серия видео одной транслокации молекулы должны быть приняты с высокоскоростной CCD-камера, которая может доходить до 2500 Гц.

4. Представитель результаты

Выполнены правильно, наш протокол позволил нам собрать ряд видео демонстрирует перемещение отдельных молекул, взаимодействующих с грузом ядерного комплекса поры в проницаемыми HeLa POM 121 клеток. (Рис. 1). Мы задались целью изображения и отслеживать переходных шагов переноса молекул декстрана через NPC в дигитонин-проницаемыми клетки HeLa стабильно выражения GFP-POM121. Клетки инкубировали с низкими концентрациями меченых молекул декстрана. Экваториальной плоскости ядра был доставлен в центр внимания с четким изображением зеленого кольца GFP флуоресценции, возбуждаемой 488-нм светом ртутной лампы. Продолжительное воздействие на GFP-СВ позволяет получить прекрасное отношение сигнал-шум (SNR) отношение к локализации срединной плоскости NE. Ранее 10 кДа декстран молекулы были найдены диффундировать через NE в течение примерно 2 мс с пространственным разрешением около 20-40 нм уровень обнаружения кадра в 500 или 1000 Гц. Такое разрешение позволяет пространственно-временного захвата от одного до двух шагах диффузии молекул декстрана через NPC, которых недостаточно для выяснения более пространственной информации для пассивной диффузии. Для захвата более мелкие шаги молекул декстрана в NPC с лучшим spatiotemporal резолюции, мы провели два главных улучшений: (я) адаптироваться быстрее обнаружения кадр 2500 Гц, чтобы захватить больше тонко диффузии, и (II) на работу выше освещенность оптической плотности для возбуждения больше фотонов из одной молекулы для получения более высоким пространственным разрешением. Эти усовершенствования позволяют нам захватить несколько этапов переходного диффузии alexa647-меченых молекул декстрана через NE по 633-нм лазерного света на освещенность 100 кВт / см ² с пространственно-временным разрешением 12 нм и 400 мс.

Как показано на рисунке 1, ряд неподвижных изображений типичных событий переноса молекул декстрана были записаны. Отслеживая пространственных траекторий отдельных транзитом молекул декстрана, тонко диффузии через NE отличались. Мы обнаружили, что Есть около 30% событий взаимодействия с СВ признали, происходящих и назначения отсеков. Среди них, декстран молекул, движущихся из цитоплазмы в СВ есть два направления: в конце ядра после диффундирующих через СВ или вернуться в цитоплазме после взаимодействия с СВ подобные ситуации происходили на экспорт событий: декстран молекул, начиная с ядра введите цитоплазме или диффузный обратно в ядро ​​после взаимодействия с NE. Такие ряды изображения содержит информацию о пространственном положении отдельных молекул в связи с NPC, а также временной информации на время пребывания молекул через NPC. На основе анализа траектории молекул декстрана в районе северо-восточного, транспортное время, эффективность и вход частота может быть определена. Время транспортировки в нашей работе могут быть идентифицированы как импорт или экспорт времени. Они были определены как среднее время пребывания молекулы декстрана в НПС, которые подвергаются импорта или экспорта. Импорт или экспорт эффективность была определена как процент от полного импорта или экспорта событий за сумму полных и неудачных событий. Частота импорта или экспорта вход относится число молекул, взаимодействующих с NE в секунду.

Рисунок 1. Выбранный видеокадров типичных событий переноса молекул декстрана через северо-восток. (А) цитоплазмы к ядру события. Одной молекулы декстрана (красное пятно) началась с цитоплазмой, взаимодействовали с СВ (зеленая линия пикселей), а закончился в ядре. Траектории события (синие линии и открытые точки) были определены и с наложенными на NE (черная линия). Зеленые и красные линии представляют 100 нм расстояние от NE на цитоплазму и ядерные стороны. С цитоплазме. N, ядра. Шкала бар: 2 мм. (B) цитоплазмы к цитоплазме события. (С) ядра к ядру события. (D) ядра к цитоплазме события.

Discussion

Необходимо соблюдать осторожность, чтобы обеспечить надлежащее колокализации СВ и одиночные молекулы в процессе эксперимента. Кроме того, важно обеспечить высокое отношение сигнал шум, особенно, когда сигнал имеет низкий уровень из-за плохой маркировки или фотообесцвечивания. Локализация точность ограничивается фонового шума (в результате вне фокуса флуоресценции, CCD шума считывания, темнового тока и других факторов).