Enda molekyl avbildning av kärntransport

Summary

Enda molekyl mikroskopi approch förutsättning nya insikter nukleära transporter.

Abstract

Nyttan av enda molekyl fluorescensmikroskopi metoder har visat sig vara av stor nytta för att förstå biologiska reaktioner under det senaste decenniet. Undersökningen av molekylära interaktioner med hög temporal och spatial upplösning djupt i cellerna har varit utmanande på grund av den inneboende svaga signaler som härrör från enskilda molekyler. Nya produktioner av Yang et al. visat att smala fältet epifluorescence mikroskopi gör visualisering av nucleocytoplasmic transporter vid enda molekyl nivå. Genom den enda molekyl strategi, viktiga kinetik, såsom kärnkraft transporttid och effektivitet för signal-beroende och oberoende last molekyler har erhållits. Här har vi beskrivit ett protokoll för metod med en förbättrad Spatiotemporal upplösning på 0,4 ms och 12 nm. Den förbättrade upplösningen möjligt för oss att fånga övergående aktiv transport och passiv händelser diffusion via nukleära porer komplex (NPC) i semi-intakta celler. Vi förväntar oss att denna metod skall användas belysa andra bindande och människohandel händelser inom cellerna.

Protocol

1. Beredning av cellens system för enda molekyl experiment

1. Minst en vecka i förväg, starta en ny kultur av HeLa cellinje från ett bestånd med upptining vid 37 ° C och sätta i en 25 cm ² kulturen kolv med 5 ml media, Inkubera cellerna vid 37 ° C inom 5% CO ₂ inkubator för 24 timmar och dela det minst 3 gånger för att ge en optimal förutsättning för cellerna. Men cellerna inte bör delas upp mer än 20 gånger på grund av benägenhet för deras tillväxttakten avta avsevärt. HeLa celler har tidigare genmanipulerade ha GFP (grönt fluorescerande protein) smält till kärnhöljet pore membranprotein POM 121. Det är nödvändigt för en exakt lokalisering av den nukleära kuvertet.
2. En dag före försöket bör celler avsedda för en enda molekyl experiment spridas på ett autoklaveras täckglas placeras i en steril petriskål. Den täckglas bör skjutas upp i DMEM (Dulbecco ändrade Eagles medium, Grand Island, NY) kompletterat med 4,5 g / l glukos, 862 mg / L GlutaMAX-I, 15 mg / ml fenolrött, 100 U / ml penicillin, 100μg/mL streptomycin och 10% nyfödd kalv serum. Volymen av en kultur bör vara 1 ml per täckglas, jämnt fördelad över hela ytan. Dessa petriskålar med täckglas sedan placeras i CO _2-inkubator och förvaras under 24 timmar före experimentet. För att en cellodling vara lämpliga för en enda molekyl experiment cellen confluency på locket glider inte bör överstiga 70% för att ge en god frihet för tvätt buffertar och proteiner av intresse genomgå den nukleära transporter.
3. På dagen för experimentet var flow-kammare konstruerades genom en övre luckan glida tillsammans med två rader av silikonfett som distanser. Det är viktigt att se till att cellerna inte torka ut under förberedelserna. Vi brukar föredra att ha två kammare göras på ett täckglas att låta två olika villkor för experimentet. Den övre luckan glider små flisor av skyddsglaset halka skära med en diamant kniv till cirka 6mm2 sattes upp och ner på en Kimwipe. Två rader med silikonfett var fint placerade längs han kanterna på täckglas med en 10 ml plastspruta som hade en pipettspets tätt knutna med Parafilm att kontrollera storleken av fettet pärla.
4. Den HeLa-cells belagd bilden var då dropp-torkas och monteras med fett som lim i ett hem-bearbetad aluminium ram - temperament, som tjänade till att hålla bilden i mikroskop provhållaren.
5. Den övre luckan glider med två rader av fett var då plockas upp med en spetsig pincett och sedan inverterat över cellen-belagda bild, som bildar ett flöde kammare. En relativt stora engagemang gjordes genom att trycka försiktigt över smorda kanter täckglas.
6. Eftersom vi gjorde två separata kammare på en cell-belagda skjut det är viktigt att ge en god tätning för att förhindra korskontaminering. För detta ändamål flera rader av silikonfett tillämpades i mellan kamrarna från toppen till botten av bilden för att täta mellanrum. Flera rader av fett var också ut på utsidan av kamrarna.
7. DMEM media lades sedan till flödet kammaren för att förhindra att celler från uttorkning. Lösning flödet främjas av en liten bit filterpapper för att absorbera vätskan ur den ur sidan av flödet kamrarna. Med stadiga händer, kan lösningen tillsättas samtidigt genom mikropipett på ena sidan av flödet kammare med ena handen, och absorberas på den andra sidan av filterpapper.
8. Efter konstruktion, var botten på bilden tvättas med en fuktad bomullspinne, två gånger med vatten och sedan två gånger med 100% etanol.
9. När bilden är monterad på mikroskop, cellerna tvättas med 2 X 25 mikroliter importera buffert (20 mM Hepes, 110 mm KOAc, 5 mm NaOAc, 2 mm MgOAc, 1 mm EGTA, pH 7,3). Cellerna permeabilized då för ~ 2 minuter med 2 X 25 mikroliter 40 mikrogram / ml digitonin i import buffert och tvättas igen med 2 X 25 mikroliter importera buffert (20 mM HEPES, 110 mm KOAc, 5 mm NaOAc, 2 mm MgOAc, 1 mm EGTA, pH 7,3) kompletterad med 1,5% polyvinylpyrrolidon (PVP, 360 kDa). Det kan vara nödvändigt att övervaka permeabilization i realtid med den ljusa fältet. PVP ingick i alla lösningar import buffert efter digitonin att förhindra osmotiska svullnad av atomkärnor. Den intakta kärnan, tillsammans med en kontrollerad cytoplasmatiskt miljö ger ett mycket förenklat transportsystem som tillåter oss att belysa den komplicerade kärntransport steg för steg. Tidigare ensemble och enda molekyl experiment som utförts i systemet har gett stor insikt i kärntekniska transporter.

2. Beredning av viktiga proteiner för kärntransport experiment

1. Med hjälp av en vanlig bakteriell omvandling den speciella stammar av E. coli (JM109) var konstruerad för att överuttrycker gener som ansvarar förproduktionen av ovannämnda proteiner av intresse och hålls i lager vid -80 ° C. (För NLS-2xGFP vi använde pTrcHisB vektor av Invitrogen). En ögla eller ~ 50 mikroliter av frysta lager av fluorescerande eller last protein uttrycker E. coli-celler överförs till 5 ml LB media med tillägg av 5μL av ampicillin (U 1000) och vuxit aerobt med skakning över natten vid 37 ° C vid 225 rpm.
2. Efter 24 timmar 500 mikroliter av mättat kulturen överförs till 500 ml LB media och skakades i 37 ° C inkubator för 5-6 timmar efter tillägg av 250 mikroliter IPTG (isopropyl _-D-1-thiogalactopyranoside) och inkuberas i ytterligare 5-6 timmar. Det är nödvändigt eftersom IPTG är laktos metabolit som utlöser utskrift av lac operon, där lacZ genen ersätts med genen av intresse och IPTG sedan används för att inducera genuttryck.
3. Kulturen är då spunnet i kylsystemet hög hastighet centrifugera vid 12000 rpm i 15 minuter och supernatanten tas bort. Cellerna är sedan suspenderade i 40 ml CelLytic B (CelLytic B ger snabb och effektiv utvinning av proteiner som är lämpliga för affinitet rening och analys.) Volymen bör baseras på 10 ml per 1 gram en pellet. 28 ìl merkaptoetanol tillsätts för att bryta disulfid obligationer och 400 ìl phenylmethanesulphonyl fluor för att avaktivera proteaser från smälta proteiner av intresse efter cellslys. En "proteas cocktail" läggs också (400 mikroliter på 0,2 mg / ml pepstatin A. 400 mikroliter på 0,2 mg / ml leupeptin, 400 mikroliter av 2 mg / ml trypsin inhibitor) se till att proteinextrakt inte bryts innan analys för mål av intresse. Vi lägger sedan till 400 mikroliter 1M imidazol, används för att eluera taggade proteiner bundet till Ni joner fastnat på ytan av pärlor i kromatografikolonnen och 1 mm DNase I, används för att försämra oönskade enkel-och dubbelsträngat DNA i 5 phosphodinucleotide och oligonukleotid fragment.
4. Rör ner blandningen i mörkret på isen i 30 minuter så att en tillräcklig tid för reaktionen, snurra på 10000 rpm i 60 minuter i kyl centrifugen. Harvest supernatanten och som förberedelse för kromatografi utföra infusionen med Ni-NTA (nickel-nitrilotriättiksyra Superflow av Qiagen) genom att snurra i rör mikrofugrör centrifugera vid max hastighet i 3 minuter och tvätta med lyseringsbuffert, upprepa spinning och tvätt tills blandningen är fri från blå nyans. Rör den resulterande blandningen långsamt i en mörk container på is i 60 minuter.
5. Utför kolonnkromatografi flyter genom 12 fraktioner enligt följande. Den första fraktionen ett flöde genom 10 ml supernatanten blandas med Ni-NTA i föregående steg. Den andra är 10 ml lyseringsbuffert (50 mM Na-fosfat, 300 mM NaCl, 20 mM imidazol, pH 8,0), tredje 10 ml buffert (10 mM imidazol, 100 mM NaCl, pH 8,0), fjärde och resten är 0,5 ml eluering buffert (250 mm imidazol, 100 mM NaCl, pH 8,0)
6. Förbered SDS-PAGE polyakrylamidgel och förbereda våra prover genom att blanda 4 mikroliter av en bråkdel och 1 mikroliter av 5X SB (300mm Tris 6,8, 25% BME, 10% SDS, 50% glycerol). För den standard vi använde 100 kb DNA stege av Invitrogen. Innan du laddar vi kokade våra prover i 5 minuter. Efter lastning vi körde gelen på 120V i 60 minuter. Sedan har vi målat, destained och slutligen torkas i en speciell gel torrare i 2 timmar vid 80C.
7. Vi ses då resultatet på gelen och ligger de fraktioner som gav det bästa resultatet. Beroende på protein av vårt intresse, bör banden placeras respektive till storleken av ett protein. Denna fraktion ska väljas för ytterligare protein rening med MonoQ och Superdex 200 (Amersham Pharmacia).
8. Koncentration sker genom att snurra på mest koncentrerade fraktioner i Nanosep filter med en porstorlek på 10K vid 14 rpm i 5 minuter, tvätta den med eluering buffert varje gång. Det är nödvändigt att fastställa det slutliga proteinkoncentrationen utnyttja BSA-analysen för ytterligare protein märkning förfarande.
9. Den inneboende grön fluorescens av NLS-2xGFP inte kan utnyttjas för enda molekyl avbildning av nukleära transporter på grund av dess dåliga foto-stabilitet och överlappande spektrum med cell autofluorescens. Således etikett vi lasten molekyler med ett överskott av en cystein-reaktiva organiska färgämne (Alexa555 eller Alexa 647 maleimide från molekylära sonder) i 2 timmar vid rumstemperatur i 50 mm natriumfosfat, 150 mM NaCl efter att minska med TCEP tris (2 - carboxyethyl) i 20 minuter. Reaktioner var släckt med 2-merkaptoetanol, och protein lösningar dialyseras att ta bort den fria färgämne.

3. Enda molekyl mikroskopi

1. Vår mikroskop som inkluderar upp en Olympus IX81 utrustad med en 1,4 NA 100x olje-nedsänkning mål (UPLSAPO 100XO, Olympus), en 35 mW 633 nm He-Ne laser (Melles Griot), en kvicksilverlampa med GFP filter upprättas, ett på -chip multiplikation få chipet kamera (Cascade 128 +, Roper vetenskaplig) och the Slidebook programpaket (Intelligent Imaging Innovations) för datainsamling och bearbetning. En optisk chopper (Newport) användes för att generera en on-off-läge av laser excitation. GFP och Alexa647 fluorescens blev upphetsad av en kvicksilverlampa och 633 nm laser respektive. Den gröna och röda fluorescensen utsläpp samlades in av samma mål, filtreras genom ett dikroisk filter (Di01-R405/488/561/635-25x36, Semrock) och ett utsläpp filter (NF01-405/488/561/635-25X5. 0, Semrock) och avbildat av en identisk CCD-kamera.
2. I enda molekyl experiment, att vi fluorescens fotoblekning tiden för den enda last molekyl vara längre än transporttid. För att bestämma fotoblekning tiden, 0,1 nM last molekyler pläterade på en glaskupa halka och bli orörlig efter 30 minuter på grund av icke-specifik absorption. Sedan är det dags loppet av fluorescens mätas. Beroende på proteinet gånger intresse photobleach är olika baserat på antalet cysteins kapabla att reagera med maleimides därför belysningen intensitet och belysning området bör justeras för att inte framkalla en preliminär fotoblekning och försäkra att lasten molekyler märkta med Alexa 647 display fluorescens längre än den last interagera med NPCs.
3. För import experiment i permeabilized celler var lasten och viktiga kofaktorer transporter adderas. Typiska importera gods reaktioner innehöll 1 mM GTP, 0,5 mikroM Importin-, 0,5 mikroM Importin-1, Ran 2 mikroM och 1 mikroM NTF2 för förenklad transport och 0,1 nm från 10KDa Dextran för passiv transport .. Lysrör last koncentrationer> 100 nM i bulk experiment, och ~ 100 pm för enda molekyl analyser. Vid dessa halter var> 99% av lasten förväntas bilda komplex med Importin och Importin. Transport uppgick övervakas av epifluorescence (om bara den relativa priser var viktiga) eller konfokala fluorescensmikroskopi (om absoluta räntor skulle önskas).
4. Första position kärnhöljet bestämdes genom brett fält epifluorescence mikroskopi genom att engagera en HBO kvicksilverlampa med en uppsättning av GFP filter för att ta en bild av NE. Pixeln intensitet inom en rad eller kolumn är ungefär vinkelrätt mot NE hade passform med Gaussisk. Den högsta positionerna i Gaussian för en viss uppsättning pixel intensitet ansågs vara det NE position för att rad och kolumn. Den högsta positionerna i en serie sådana Gaussians var då passform med ett andra gradens polynom, vilket ger sökvägen till NE inom hela bilden.
5. När NE är lokaliserad, är det viktigt att bli av med alla autofluorescens använder en 633 nm He-Ne laser tills den är helt photobleached är oftast över 60 sekunder räcker.
6. Exempel på molekyler ska sedan förvaras i en 1,5% lösning av PVP och blandningen tillsätts flödet kammaren i en volym på 25 L och sedan släpas genom kammaren tillämpa en veke av filtrerpapper. En fullkomlig försiktighet bör iakttas vid tillägg av proteiner importerar lasten till permeabilized cellerna direkt efter kärnhöljet lokalisering eftersom fokus lätt kan störas av någon kraftig rörelse.
7. Så snart lasten molekyler läggs, 633 nm He-Ne laser användes för att belysa transport banor transit molekyler. En optisk chopper (Newport) bör engageras vid ca 5 Hz för att undvika fotoblekning på grund av en hög effekttäthet av laser, samt att möjliggöra en ny del av långfristiga photobleached enstaka molekyler att närma sig NE. En serie av videor från enda molekyl translokationer bör tas med en snabb CCD-kamera som kan gå upp till 2500 Hz.

4. Representativa resultat

Utförs korrekt, får våra protokoll för oss att samla ett antal videor som visar på flyttning av enstaka last molekyler interagerar med det nukleära por komplex i permeabilized HeLa POM 121 celler. (Fig. 1). Vi gav oss ut för att bild och spåra övergående transport steg av dextran molekyler genom den nationella folkkongressen i digitonin-permeabilized HeLa celler som stabilt som uttrycker GFP-POM121. Cellerna inkuberades med låga halter av de märkta dextran molekyler. Den ekvatorn plan kärnan togs i fokus med en tydlig bild av grön ring av GFP fluorescens upphetsad av en 488-nm kvicksilver lampa ljus. En lång tid exponering av GFP-NE gör att vi kan få en utmärkt signal-brus (SNR) förhållandet att lokalisera mitt plan NE. Tidigare 10 kDa dextran molekyler befanns diffus genom NE inom ca 2 ms med en rumslig upplösning på ca 20-40 nm med en upptäckt bildfrekvens på 500 eller 1000 Hz. En sådan Spatiotemporal upplösning möjliggör infångning av endast en till två spridning steg av dextran molekyler genom NPC som inte är tillräckligt för att belysa mer rumslig information för passiv diffusion. För att fånga fler små steg av dextran molekyler inom NPC med en bättre spatiotemporal upplösning, har vi genomfört två stora förbättringar: (i) att anpassa sig snabbare upptäckt ram av 2500 Hz för att fånga mer fina spridning steg, och (ii) att använda en högre belysning optisk densitet att excitera fler fotoner från enstaka molekyler för att få en högre rumslig upplösning. Dessa förbättringar gör att vi kan fånga upp flera steg av övergående spridning av alexa647 märkt dextran molekyler över NE med en 633-nm laserljus på irradians på 100 kW / cm ² med en Spatiotemporal upplösning på 12 nm och 400 ms.

Som visas i figur 1, var en serie stillbilder av typiska transporter händelser av dextran molekyler registreras. Genom att spåra den rumsliga banor enskilda transiteras dextran molekyler, var de små steg av diffusion genom NE särskiljas. Vi fann att det finns cirka 30% av interaktion händelser med NE har erkänt sitt ursprung och fack destination. Bland dem, dextran molekyler flyttar från cytoplasman till NE ha två destinationer: slutet i kärnan efter att sprida via NE eller flytta tillbaka till cytoplasman efter interagera med NE liknande situationer uppstod för export händelser: dextran molekyler från kärnan Ange cytoplasman eller diffus tillbaka till kärnan efter interagera med NE. Sådana bildserie innehåller information om den rumsliga placeringen av enstaka molekyler med avseende på NPC, samt temporal information om uppehållstid av molekyler genom den nationella folkkongressen. Genom att analysera banor av dextran molekyler runt området i NE, kan transporttid, effektivitet och entré frekvens fastställas. Transporten tid i vårt arbete kan identifieras som import eller export tiden. De var definieras som den genomsnittliga uppehållstid av dextran molekyler inom NPC som genomgår importen eller exporten. Den importera eller exportera effektiviteten definierades som den andel av hela importen eller de händelser som exporterar över summan av den kompletta och misslyckade händelser. Den importera eller exportera entré frekvensen avser antalet molekyler interagerar med NO under en sekund.

Figur 1. Valda videobildrutor typiska transporter händelser av dextran molekyler via NE. (A) en cytoplasman till cellkärnan händelse. En enda dextran molekyl (röd prick) startade från cytoplasman, interagerade med NE (grön pixel linje), och slutade i kärnan. De banor av händelsen (blå linjer och öppna punkter) fastställdes och överlagras med NE (svart linje). Den gröna och röda linjerna representerar 100 nm-avstånd från NE om cytoplasman och den nukleära sidan. C, cytoplasman. N, kärnan. Skala bar: 2 mm. (B) A cytoplasman till cytoplasman händelse. (C) en kärna till kärna händelse. (D) en kärna till cytoplasman händelse.

Discussion

Försiktighet måste vidtas för att försäkra en korrekt colocalization av NE och enstaka molekyler under experimentet. Det är också viktigt att ge en hög andel signalbrus, särskilt när signalen är låg på grund av dålig märkning eller fotoblekning. Lokalisering precision är begränsad av bakgrundsljud (som härrör från out-of-fokus fluorescens, CCD avläsning buller, mörka nuvarande och andra faktorer).