Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

Summary

Einzel-Molekül-Mikroskopie approch neue Einblicke in atomare Transport.

Abstract

Der Nutzen des einzelnen Moleküls Fluoreszenzmikroskopie Ansätze ist nachgewiesen worden, von einem großen Anspruch in das Verständnis von biologischen Reaktionen während des letzten Jahrzehnts werden. Die Untersuchung molekularer Wechselwirkungen mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung tief in den Zellen blieb Herausforderung aufgrund der inhärent schwachen Signalen, die aus einzelnen Molekülen. Neuere Arbeiten von Yang et al. gezeigt, dass Schmalband-Bereich Epifluoreszenzmikroskopie Visualisierung von nukleozytoplasmatischen Transport ermöglicht auf der Ebene einzelner Moleküle. Durch die einzigen Molekül Ansatz, wichtige Kinetik, wie Kerntransport Zeit und Effizienz, für die Signalverarbeitung und-unabhängige Cargomoleküle gewonnen wurden. Hier haben wir beschrieben, ein Protokoll für den methodischen Ansatz mit einer verbesserten zeitlichen Auflösung von 0,4 ms und 12 nm aufweisen. Die verbesserte Auflösung ermöglichte es uns, vorübergehend den aktiven Transport und passive Diffusion Ereignisse durch die Kernporenkomplexe (NPC) erfassen in semi-intakten Zellen. Wir erwarten, dass diese Methode, um bei der Aufklärung anderer bindender und Menschenhandel Ereignisse innerhalb von Zellen verwendet werden.

Protocol

1. Vorbereitung der Zellen für einzelnes Molekül Experiment

1. Mindestens eine Woche im Voraus, starten Sie eine neue Kultur der HeLa-Zelllinie aus einem Bestand von Auftauen bei 37 ° C und legte ihn in eine 25 cm ² Kulturflasche mit 5 ml Medium, Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C innerhalb von 5% CO ₂ Inkubator für 24 Stunden und spaltete es mindestens 3-mal, um eine optimale Voraussetzung für die Zellen. Doch die Zellen nicht mehr als 20 Mal wegen Neigung ihrer Wachstumsrate erheblich langsamer gespalten werden. HeLa-Zellen wurden zuvor gentechnisch so verändert GFP (grün fluoreszierendes Protein) fusioniert mit dem Kernhülle Pore Membranprotein POM 121 haben. Es ist notwendig für eine genaue Lokalisierung der Kernhülle.
2. Einen Tag vor dem Versuch sollten die Zellen für ein einzelnes Molekül Experiment soll auf einer autoklaviert Deckglas in eine sterile Petrischale verteilt werden. Das Deckglas sollte in DMEM (Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium, Grand Island, NY) mit 4,5 g / l Glucose, 862 mg / L Glutamax-I, 15 mg / mL Phenolrot, 100 U / ml Penicillin, 100μg/mL ergänzt ausgesetzt werden Streptomycin und 10% Neugeborenen Kälberserum. Das Volumen einer Kultur sollte 1ml pro Deckglas, gleichmäßig über die gesamte Oberfläche verteilt werden. Diese Petrischalen mit dem Deckel rutscht dann in die CO _2-Inkubator gelegt und hielt 24 Stunden vor dem Experiment. Um für eine Zellkultur zu sein für ein einzelnes Molekül Experiment geeignet die Zellkonfluenz auf das Deckglas sollte 70% nicht überschreiten, um eine gute Freiheit für Waschpuffer und Proteine ​​von Interesse die sich im nuklearen Verkehrs.
3. Am Tag des Experiments wurden flow-Kammern, die durch das Hinzufügen einer oberen Abdeckung zusammen Slip mit zwei Zeilen Silikonfett als Abstandshalter gebaut. Es ist unerlässlich, um sicherzustellen, dass die Zellen nicht austrocknen während der Vorbereitung. Wir bevorzugen in der Regel auf zwei Kammern auf einer Abdeckung aus Schlupf an zwei verschiedene Bedingungen für das Experiment zu ermöglichen. Die obere Abdeckung gleitet kleine Glassplitter Deckglas mit einer Diamant-Messer geschnitten werden ca. 6mm2 Kopf waren auf einer Kimwipe platziert. Zwei Linien der Silikonfett wurden fein entlang er Kanten des Deckglases mit einem 10 mL Kunststoff-Spritze, die eine Pipettenspitze dicht mit Parafilm an der Größe der Fett bead Kontrolle gestellt hatte.
4. Die HeLa-Zellen beschichtete Folie wurde dann getrocknet tropfen und montiert mit Fett als Kleber in einem Heim-gefräste Alu-Rahmen - Temperament, die auf die Folie in das Mikroskop Probenhalter halten serviert.
5. Die obere Abdeckung gleitet mit den zwei Linien von Fett wurden dann mit einer spitzen Pinzette und dann über die Zell-beschichteten Objektträger invertiert aufgenommen und bilden eine Flusskammer. Eine relativ feste Bindung wurde durch leichtes Eindrücken über die gefettete Kanten des Deckglases gemacht.
6. Da wir zwei separate Kammern auf einer Zelle-beschichtete Folie ist es wichtig, eine gute Abdichtung, um eine Kreuzkontamination zu verhindern. Hierzu werden mehrere Linien des Silikonfett waren in zwischen den Kammern von oben nach unten die Folie aufgetragen, um den Abstand zu versiegeln. Mehrere Linien der Fett waren auch an den Außenseiten der Kammern gestellt.
7. DMEM-Medium wurde dann auf die Flusskammer hinzugefügt, um die Zellen vor dem Austrocknen zu verhindern. Lösung Flow wurde durch ein kleines Stück Filterpapier gefördert werden, um die Flüssigkeit zu absorbieren aus der Austrittsseite des Strömungskammern. Mit ruhige Hände, könnten Lösung gleichzeitig durch Mikropipette auf der einen Seite des flow-Kammer mit einer Hand hinzugefügt werden, und absorbiert auf der anderen Seite durch Filterpapier.
8. Nach dem Bau wurde die Unterseite der Folie mit einem angefeuchteten Wattestäbchen Wattestäbchen, zweimal mit Wasser und dann zweimal mit 100% Ethanol.
9. Sobald die Folie auf dem Mikroskop montiert ist, die Zellen mit 2 X 25 ul Import-Puffer (20 mM Hepes, 110 mM KOAc, 5 mM NaOAc, 2 mM MgOAc, 1 mM EGTA, pH 7,3) gewaschen. Die Zellen werden dann für ca. 2 Minuten mit 2 X 25 ul 40 ug / mL Digitonin in Import-Puffer permeabilisiert und wieder gewaschen mit 2 X 25 ul Import-Puffer (20 mM HEPES, 110 mM KOAc, 5 mM NaOAc, 2 mM MgOAc, 1 mM 360 kDa); EGTA, pH 7,3) mit 1,5% Polyvinylpyrrolidon (PVP ergänzt. Es kann notwendig sein, die Permeabilisierung in Echtzeit über den hellen Bereich überwachen. PVP wurde in allen Import-Pufferlösungen enthalten nach Digitonin osmotischen Schwellung der Kerne zu verhindern. Die intakte Kern, zusammen mit einer kontrollierten cytoplasmatischen Umgebung stellt ein stark vereinfachtes Verkehrssystem, das uns der komplizierten Kerntransport Schritt für Schritt erläutern können. Vorherige Ensemble und Einzel-Molekül-Experimente, die im System durchgeführt haben große Einblicke in atomare Transport zur Verfügung gestellt.

2. Vorbereitung von Proteinen für die nukleare Transport Experiment

1. Mit Hilfe einer herkömmlichen bakteriellen Transformation die spezielle Stämme von E. coli (JM109) wurden entwickelt, um die Gene, die für überexprimierenProduktion der oben genannten Proteine ​​von Interesse und werden in Lager bei -80 ° C gehalten (Für NLS-2xGFP verwendeten wir pTrcHisB Vektor von Invitrogen). Eine Öse oder ~ 50 ul von gefrorenen Aktien von fluoreszierenden oder Fracht exprimierenden E. coli-Zellen werden zu 5 ml des LB-Medium mit Zusatz von 5μL Ampicillin übertragen (U 1000) und aerob unter Schütteln über Nacht bei 37 ° C bei 225 rpm gezüchtet.
2. Nach 24 Stunden 500 mL gesättigter Kultur wird in 500 ml LB-Medium übertragen und erschüttert in den 37 ° C Inkubator für 5-6 Stunden nach der Zugabe von 250 ul IPTG (Isopropyl _-D-1-thiogalactopyranosid) resuspendiert und für andere 5-6 Stunden. Es ist notwendig, weil IPTG ist ein Laktose-Metaboliten, der die Transkription des lac-Operon, wo das lacZ-Gen mit dem Gen von Interesse und IPTG ersetzt wird dann verwendet, um die Genexpression zu induzieren auslöst.
3. Die Kultur wird dann in die Kühlung Hochgeschwindigkeits-Zentrifuge bei 12000 rpm für 15 Minuten zentrifugiert und der Überstand wird verworfen. Die Zellen werden dann in 40 ml CelLytic B (CelLytic B führt zu einer schnellen und effizienten Extraktion von Proteinen, die für Affinitätsreinigung und Analyse.) Das Volumen auf 10 mL pro 1 Gramm eines Pellets basieren sollte resuspendiert. 28 ul Mercaptoethanol zugesetzt wird, um Disulfidbindungen und 400 ul der phenylmethanesulphonyl Fluorid zu brechen, um Proteasen verdauen Proteine ​​von Interesse nach Zell-Lyse zu deaktivieren. Eine "Protease-Cocktail" wird auch hinzugefügt (400 ul von 0,2 mg / ml Pepstatin A. 400 ul 0,2 mg / ml Leupeptin, 400 ul 2 mg / ml Trypsin-Inhibitor), um sicherzustellen, dass Eiweißextrakte nicht vor der Analyse degradieren für Ziele von Interesse. Wir fügen Sie dann 400 ul 1M Imidazol, wird verwendet, um markierte Proteine ​​gebunden Ni-Ionen an der Oberfläche der Kügelchen in die Chromatographiesäule und 1mm DNase I, verwendet werden, um unerwünschte Einzel-und Doppelstrang-DNA in 5 phosphodinucleotide und Oligonukleotid degradieren eluieren Fragmente.
4. Rühren Sie die Mischung in Dunkelheit auf Eis für 30 Minuten, um eine angemessene Zeit für die Reaktion, Spin bei 10000 rpm für 60 Minuten in der Kühlzentrifuge ermöglichen. Ernte der Überstand und in Vorbereitung für die Chromatographie durchführen Infusion mit Ni-NTA (Nickel-Nitrilotriessigsäure Superflow von Qiagen) durch Drehen in Mikrozentrifuge Zentrifugenröhrchen bei max Geschwindigkeit für 3 Minuten und Waschen mit Lysepuffer, wiederholen Spinnen und Waschen, bis die Mischung frei von jeglichen Blaustich. Rühren Sie die erhaltene Mischung langsam in einem dunklen Behälter auf Eis für 60 Minuten.
5. Führen Sie die Säulenchromatographie durchströmende 12 Fraktionen wie folgt. Die erste Fraktion ist ein Durchfluss von 10 mL Überstand mit Ni-NTA im vorherigen Schritt gemischt. Der zweite ist 10 ml Lysepuffer (50 mM Na-Phosphat, 300 mM NaCl, 20 mM Imidazol, pH 8,0), dritter 10 ml Puffer (10 mM Imidazol, 100 mM NaCl, pH 8,0), der vierten und der Rest 0,5 ml Elutionspuffer (250 mM Imidazol, 100 mM NaCl, pH 8,0)
6. Bereiten Sie die SDS-PAGE-Polyacrylamidgel und bereiten unsere Proben durch Mischen 4 ul einer Fraktion und 1 ul 5X SB (300mm Tris 6,8, 25% BME, 10% SDS, 50% Glycerin). Für den Standard, den wir verwendet 100 kb DNA-Leiter von Invitrogen. Vor dem Laden kochten wir unsere Proben für 5 Minuten. Nach dem Laden liefen wir dem Gel bei 120V für 60 Minuten. Dann haben wir gebeizt, entfärbt und schließlich in einem speziellen Gel Trockner für 2 Stunden bei 80 ° C getrocknet.
7. Wir haben dann die Ergebnisse auf dem Gel angesehen und befindet sich die Fraktionen, die das beste Ergebnis lieferte. Je nach Protein des Interesses, sollten die Bänder jeweils auf die Größe eines Proteins befinden. Dieser Anteil sollte für die weitere Reinigung von Proteinen mit MonoQ und Superdex 200 (Amersham Pharmacia) ausgewählt werden.
8. Die Konzentration wird durch Drehen der am stärksten konzentrierten Fraktionen in Nanosep Filter mit einer Porengröße von 10K bei 14 rpm für 5 Minuten, Waschen mit Elutionspuffer jedes Mal durchgeführt. Es ist notwendig, um die endgültige Proteinkonzentration unter Verwendung des BSA-Assay für weitere Proteinmarkierung Verfahren zu bestimmen.
9. Der innere grüne Fluoreszenz des NLS-2xGFP kann nicht für einzelne Molekül Abbildung von nuklearen Transport wegen der schlechten Foto-Stabilität und überlappt Spektrum mit Zell-Autofluoreszenz genutzt werden. So markieren wir die Fracht-Moleküle mit einem Überschuss an Cystein-reaktiven organischen Farbstoff (Alexa555 oder Alexa 647 Maleimid von Molecular Probes) für 2 Stunden bei Raumtemperatur in 50 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl nach Reduktion mit TCEP Tris (2 - carboxyethyl) für 20 Minuten. Die Reaktionen wurden mit 2-Mercaptoethanol abgeschreckt, und das Protein-Lösungen wurden dialysiert, um den freien Farbstoff zu entfernen.

3. Einzel-Molekül-Mikroskopie

1. Unser Mikroskop einrichten beinhaltet eine Olympus IX81 mit 1,4 NA 100x Ölimmersionsobjektiv (UPLSAPO 100XO, Olympus) ausgestattet, einem 35 mW 633 nm He-Ne-Laser (Melles Griot), eine Quecksilberlampe mit GFP-Filter eingerichtet, ein auf -Chip-Multiplikation zu gewinnen charge-coupled device Kamera (Cascade 128 +, Roper Scientific) und the Slidebook Software-Paket (Intelligent Imaging Innovations) für die Datenerfassung und-verarbeitung. Ein optischer Chopper (Newport) wurde verwendet, um eine On-Off-Modus der Laseranregung zu generieren. GFP und Alexa647 Fluoreszenz wurde durch eine Quecksilberlampe und 633 nm Laser-bzw. aufgeregt. Die grünen und roten Fluoreszenz-Emission wurde von dem gleichen Ziel, durch einen dichroitischen Filter (Di01-R405/488/561/635-25x36, Semrock) und ein Emissionsfilter (NF01-405/488/561/635-25X5 gefiltert gesammelt. 0, Semrock) und abgebildet durch eine identische CCD-Kamera.
2. In Einzelmolekül-Experimente ermöglichen wir die Fluoreszenz photobleaching Zeit der einzelnen Fracht-Molekül, die länger als Transportzeit. Zur Bestimmung der photobleaching Zeit werden 0,1 nM Fracht-Moleküle auf einer Glasabdeckung vernickelt schlüpfen und sich immobile nach 30 Minuten durch unspezifische Absorption. Dann wird der zeitliche Verlauf der Fluoreszenz gemessen. Je nach Protein von Interesse photobleach Mal anders sein wird basierend auf der Anzahl der Cysteine ​​in der Lage, mit Maleinimide, also die Beleuchtungsstärke und Beleuchtungsbereich reagieren sollten angepasst werden, um nicht zu induzieren eine vorläufige Bleichen und sicherzustellen, dass Cargomoleküle mit Alexa 647 Display beschriftet Fluoreszenz für länger als die Ladungen interagieren mit NPCs.
3. Für den Import Experimente in permeabilisierten Zellen wurden die Fracht-und wichtigen Transport-Kofaktoren addiert. Typische Importfracht Reaktionen enthielt 1 mM GTP, 0,5 uM Importin-, 0,5 uM Importin-1, Ran 2 pM und 1 nM NTF2 für einen erleichterten Transport und 0,1 nM 10KDa Dextran für den passiven Transport .. Fluorescent Fracht-Konzentrationen wurden> 100 nM in loser Schüttung Experimente und ~ 100 pM für Einzel-Molekül-Assays. Bei diesen Konzentrationen war> 99% der Ladung zu erwarten Komplexe mit Importin und Importin bilden. Transport-Rate wurde durch Epifluoreszenz (wenn auch nur relativen Geschwindigkeiten wichtig waren) oder konfokalen Fluoreszenzmikroskopie (wenn absolute Preise gewünschten wurden) überwacht.
4. Zuerst wird die Position der Kernhülle wurde von wide-field Epifluoreszenzmikroskopie durch Einlegen eines HBO Quecksilber-Lampe mit einer Reihe von GFP-Filter, um ein Bild von der NE nehmen bestimmt. Die Pixel-Intensitäten innerhalb einer Zeile oder Spalte sind annähernd senkrecht zu den NE wurden mit Gaussian fit. Die Peak-Positionen der Gaußschen für eine bestimmte Gruppe von Pixelintensitäten galt als der NE Position für die betreffende Zeile und Spalte. Die Peak-Positionen aus einer Reihe von solchen Gaussians wurden dann mit einem Polynom zweiten Grades fit, wodurch der Weg der NE in das gesamte Bild.
5. Sobald die NE lokalisiert ist, es wesentlich ist, um loszuwerden, alle Autofluoreszenz Verwendung eines 633 nm He-Ne-Laser, bis es vollständig gebleicht ist, ist in der Regel mehr als 60 Sekunden ausreichend.
6. Probenmoleküle sollte dann in eine 1,5% ige Lösung von PVP gehalten werden und die Mischung hinzugefügt, um die Flusskammer in einem Volumen von 25 L und dann durch die Kammer der Anwendung einen Docht aus Filterpapier gezogen. Eine völlige Sorgfalt sollte bei der Zugabe des Import-Güter-Proteine ​​an die permeabilisierten Zellen direkt nach der Kernhülle Lokalisierung eingenommen werden, da der Fokus kann durch jeden kräftigen Bewegung gestört werden.
7. Sobald die Fracht-Moleküle zugegeben, 633 nm He-Ne-Laser verwendet werden, um den Transport Bahnen der Transit-Moleküle leuchten war. Ein optischer Chopper (Newport) sollte bei ca. 5 Hz eingestellt werden, um die Ausbleichen durch eine hohe Leistungsdichte des Lasers, sowie, dass ein neues Teil nicht gebleicht einzelne Moleküle zu den NE-Ansatz zu vermeiden. Eine Reihe von Videos von einzelnen Molekül-Translokationen sollte mit einem High-Speed-CCD-Kamera, die sogar auf bis zu 2500 Hz entnommen werden.

4. Repräsentative Ergebnisse

Korrekt ausgeführt, erlaubt unser Protokoll wir eine Reihe von Videos zeigen die Translokation von einzelnen Cargomoleküle Interaktion mit dem Kernporenkomplex in permeabilisierten HeLa POM 121 Zellen zu sammeln. (Abb. 1). Wir wollten Bild und verfolgen die vorübergehenden Transport Schritte Dextranmolekülen durch den NPC in Digitonin-permeabilisierten HeLa-Zellen stabil exprimieren GFP-POM121. Die Zellen wurden mit niedrigen Konzentrationen des markierten Dextranmolekülen inkubiert. Die Äquatorebene des Kerns wurde in den Fokus mit einem klaren Bild der grünen Ring der GFP-Fluoreszenz von einem 488-nm Quecksilberlampe Licht angeregt gebracht. Eine Langzeitbelichtung von GFP-NE ermöglicht es uns, ein ausgezeichnetes Signal-Rausch-Abstand (SNR)-Verhältnis zu erhalten zu lokalisieren Mittelebene der NE. Bisher 10 kDa Dextran-Moleküle gefunden wurden, um durch die NE innerhalb von ca. 2 ms diffuse mit einer räumlichen Auflösung von etwa 20-40 nm durch einen Nachweis Bildrate von 500 oder 1000 Hz. Solch ein örtlicher und zeitlicher Auflösung erlaubt das Erfassen von nur 1.59 Diffusion Schritte Dextranmolekülen durch den NPC, das nicht genug, um mehr Raum für passive Diffusion aufzuklären. Um mehr feinen Schritten von Dextran-Moleküle innerhalb der NPC-Capture mit einem besseren Raumentotemporal Auflösung, haben wir zwei wichtige Verbesserungen durchgeführt: (i) zu einer schnelleren Erkennung Bildrate von 2500 Hz Anpassung an feiner Diffusion Schritte zu erfassen, und (ii) auf eine höhere Ausleuchtung optische Dichte zu verwenden, um mehr Photonen aus einzelnen Molekülen anregen zu erhalten eine höhere räumliche Auflösung. Diese Verbesserungen ermöglichen es uns, mehrere Schritte von transienten Diffusion von Alexa647-markierten Dextranmolekülen über den NE Erfassung von einem 633-nm Laserlicht bei Einstrahlung von 100 kW / cm ² mit einer zeitlichen Auflösung von 12 nm und 400 ms.

Wie in Abbildung 1 gezeigt, wurden eine Reihe von Standbildern von typischen Transport Ereignisse Dextranmolekülen aufgezeichnet. Durch die Verfolgung der räumlichen Bahnen einzelner Transit Dextranmolekülen wurden die feinen Schritten von Diffusion durch die NE unterschieden. Wir fanden, dass es etwa 30% der Interaktion Veranstaltungen mit dem NE haben erkannt, Ursprung und das Ziel Fächern. Unter ihnen sind Dextranmolekülen bewegt aus dem Cytoplasma in die NE zwei Ziele: Ende in den Zellkern nach Diffusion durch die NE oder verschieben zurück in das Zytoplasma nach Interaktion mit dem NE Die ähnlichen Situationen für den Export Ereignisse: Dextranmolekülen beginnend vom Kern in das Zytoplasma oder diffuse zurück in den Zellkern, nachdem die Interaktion mit dem NE. Solche Bildserien enthalten Informationen über die räumliche Lage der einzelnen Moleküle im Hinblick auf die NPC sowie zeitliche Informationen über die Verweilzeit der Moleküle durch die NPC. Durch die Analyse der Trajektorien Dextranmolekülen rund um den Bereich der NE, kann die Transportzeit, Effizienz und Eingang Frequenz bestimmt werden. Die Transportzeit bei unserer Arbeit kann als Import oder den Export der Zeit identifiziert werden. Sie wurden als die durchschnittliche Verweildauer von Dextran-Moleküle innerhalb der NPCs, die den Import oder Export unterziehen definiert. Die Einfuhr oder Ausfuhr Effizienz wurde als Prozentsatz des gesamten Import oder den Export Veranstaltungen über die Summe der vollständigen und abortive Ereignisse definiert. Die Einfuhr oder Ausfuhr Eingang Frequenz bezeichnet die Anzahl der Moleküle interagieren mit dem NE während einer Sekunde.

Abbildung 1. Gewählte Video-Frames von typischen Transport Ereignisse Dextranmolekülen durch die NE. (A) A Zytoplasma-to-Kern Veranstaltung. Ein einziger Dextranmolekül (roter Fleck) gestartet aus dem Cytoplasma, interagiert mit den NE (grüne Pixel-Linie), und endete in den Zellkern. Die Flugbahnen der Veranstaltung (blaue Linien und offene Punkte) wurden bestimmt und überlagert mit der NE (schwarze Linie). Die grünen und roten Linien repräsentieren 100 nm-Abstand von der NE auf dem Zytoplasma und dem Kern-Seite. C, das Zytoplasma. N, den Zellkern. Maßstab: 2 mm. (B) A Zytoplasma-to-Zytoplasma Veranstaltung. (C) Ein Kern-zu-Kern-Veranstaltung. (D) Ein Kern-zu-Zytoplasma Veranstaltung.

Discussion

Es muss darauf geachtet, um eine ordnungsgemäße Kolokalisation von NE und einzelne Moleküle während des Experiments zu versichern. Es ist auch wichtig, um ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis bieten, vor allem, wenn das Signal schwach ist aufgrund der schlechten Kennzeichnung oder Ausbleichen. Localization Präzision wird durch Hintergrundgeräusche (aus out-of-focus-Fluoreszenz, CCD Ausleserauschen, Dunkelstrom und anderen Faktoren) begrenzt.