Tek Molekül Görüntüleme Nükleer Ulaştırma

Summary

Tek molekül mikroskopi, nükleer taşıma yeni bakış açıları sağlanan Yaklaşım.

Abstract

Tek bir molekülün floresan mikroskopi yaklaşımlar programı, son on yıl içinde biyolojik reaksiyonlar anlamak içinde büyük bir boşuna kanıtlanmıştır. , Hücre içinde derin yüksek zamansal ve mekansal kararları moleküler etkileşimler soruşturma nedeniyle tek tek moleküllerin kaynaklanan doğal olarak zayıf sinyaller zorlu kalmıştır. Yang ve ark tarafından yapılan son çalışmalar. dar alan Epifloresans mikroskopi tek molekül düzeyinde Nükleositoplazmik taşıma görselleştirme izin verdiğini göstermiştir. Sinyal bağımlı ve bağımsız kargo moleküller için tek bir molekülün yaklaşım, önemli kinetik, nükleer taşıma süresi ve verimlilik gibi, olarak elde edilmiştir. Burada, geliştirilmiş bir uzaysal çözünürlüğe sahip 0.4 ms ve 12 nm metodolojik yaklaşım için bir protokol. Geliştirilmiş çözünürlük, bizi yarı sağlam hücreler nükleer gözenek kompleksleri (NPC) ile geçici aktif transport ve pasif difüzyon olayları yakalamak için olanak sağladı. Bu yöntem, hücrelerin içindeki diğer bağlayıcı ve ticareti olayların nedenlerine açıklık kullanılmak üzere bekliyoruz.

Protocol

1. Hücre sistemi tek bir molekül deney için hazırlanması

1. 37 ° C çözülme ve 5 ml medya ile 25 cm ² kültür şişesi koyarak en az bir hafta önceden, bir stok taze bir HeLa hücre hattı kültürü başlatmak, 37 hücreleri inkübe ° C,% 5 _CO 2 24 saat kuvöz ve hücreler için optimum bir koşulu sağlamak için en az 3 kez bölünmüş. Ancak hücreler, onların büyüme hızı, eğilimine önemli ölçüde yavaşlaması nedeniyle 20 kat daha fazla bölünmüş olmamalıdır. HeLa hücrelerinde daha önce genetik, nükleer zarf gözenek membran proteini POM 121 erimiş GFP (yeşil floresan protein) için tasarlanmış. Çekirdek zarı kesin lokalizasyonu için gereklidir.
2. Bir gün önce deney, tek bir molekülün deney için tasarlanmıştır hücreler steril bir Petri kabındaki yerleştirilen bir otoklavlanmış kapak astar üzerine yayılmış olmalıdır. Lamel DMEM (Dulbecco'nun modifiye Eagle orta, Grand Island, NY) 4.5 g / L glikoz, 862 mg / L GlutaMAX-I, 15 mg / ml fenol kırmızısı, 100 U / ml penisilin, 100μg/mL ile desteklenmiş askıya alınmalı streptomisin ve% 10 yeni doğan buzağı serumu. Bir kültürün tüm yüzey üzerinde eşit dağıtılmış kapak kayma başına 1 ml, hacmi olmalıdır. Bu kapak fişleri ile Petri kutularına sonra CO ₂ kuvöz içine yerleştirilir ve deney öncesinde 24 saat bekletilir. Tek bir molekülün deneyi için uygun bir hücre kültürü için kapak kayma confluency hücre nükleer taşıma uygulanan faiz yıkama tamponları ve protein için iyi bir özgürlük sağlamak için% 70 geçmemelidir.
3. Deney günü, silikon yağ ayırıcılar olarak iki satırlık bir üst kapağı ile birlikte kayma ekleyerek, akış odaları inşa edildi. Bu hücrelerin hazırlanması sırasında kuru değil emin olmak için şarttır. Biz genellikle, bir kapak yapılmış iki odadan deney için iki farklı koşullar izin kaymayı tercih. Üst kapağı yaklaşık 6mm2 Kimwipe ters yerleştirildi elmas bıçakla kesilmiş cam kapak kayma küçük dilimler sığar. İki satır silikon gres ince sıkıca yağ boncuk boyutunu kontrol Parafilm ile bağlı bir pipet 10 ml plastik şırınga ile kapak fişleri kenarları boyunca yerleştirilir.
4. Sonra HeLa hücre kaplı slayt damla kurutulmuş ve yapıştırıcı olarak gres yağı ile bir ev işlenmiş alüminyum çerçeve monte - öfke, mikroskop numune tutucu slayt tutmak için hizmet.
5. Gres iki çizgi ile üst kapağı fişleri sonra bir akış odasının oluşturan hücre kaplı slayt üzerinde ters sivri uçlu bir cımbız ve sonra tutuklandılar. Yağlanmış kenarları lamel üzerine hafifçe bastırılarak nispeten sağlam bir eklenti yapıldı.
6. Bir hücre kaplı slayt üzerinde yapılan iki ayrı odaları, çapraz bulaşmayı önlemek için iyi bir sızdırmazlık sağlamak için esastır. Bu amaç için silikon gres birkaç satır dışında mühür slayt alt üst odaları arasında uygulandı. Gres birkaç satır odalarının dış tarafta da konuldu.
7. DMEM medya sonra hücrelerin kurumasını önlemek için akış odasına eklendi. Çözüm akış akış odaları çıkış tarafında sıvı dışarı emmek için küçük bir parça filtre kağıdı ile terfi etti. Kararlı ellerle, çözüm mikropipet tarafından tek elle akış odasının bir tarafında aynı anda eklenen olabilir ve filtre kağıdı ile diğer tarafında emilir.
8. İnşaattan sonra, slayt alt iki kez su ile ıslatılmış bir pamuk uçlu çubukla ile yıkanır ve sonra iki kez% 100 etanol ile.
9. Slayt mikroskop üzerine monte edildikten sonra, hücreleri, 2 X 25 mcL ithalat tamponu (20 mM Hepes, 110 mM KOAc, 5 mM NaOAc, 2 mM MgOAc, 1 mM EGTA pH 7.3) ile yıkanır. Bu hücreler daha sonra, ithalat tampon 2 X 25 mcL 40 mcg / mL digitonin ~ 2 dakika için permeabilize ve 2 X 25 mcL ithalat tamponu (20 mM Hepes, 110 mM KOAc, 5 mM NaOAc, 2 mM MgOAc, 1 mM ile tekrar yıkanır 360 kDa); EGTA, pH 7.3),% 1.5 Polyvinylpyrrolidone (PVP ile desteklenmiş. Parlak alanını kullanarak gerçek zamanlı permeabilization izlemek için gerekli olabilir. Çekirdeklerin osmotik şişme önlemek için digitonin sonra PVP tüm ithalat tampon çözeltiler dahil edildi. Kontrollü bir sitoplazmik ortam ile birlikte sağlam bir çekirdeği, bize karmaşık nükleer taşıma adım adım aydınlatmak için büyük ölçüde basitleştirilmiş bir taşıma sistemi sağlar. Sisteme yapılan Önceki topluluğu ve tek-molekül deneyler büyük nükleer taşıma anlayışlar sağladı.

2. Nükleer taşıma deney için gerekli proteinlerin hazırlanması

1. Geleneksel bir bakteriyel dönüşüm sayesinde E.coli (JM109) özel suşları sorumlu genlerin eksprese amacıyla tasarlanmıştır.yukarıda belirtilen faiz proteinlerin üretimi ve -80 ° C'de stokta tutulur (NLS-2xGFP için Invitrogen pTrcHisB vektör). Ampisilin 5μL eklenmesi ile, E. Coli hücrelerin ifade floresan veya kargo protein dondurulmuş stokları loopful veya ~ 50 mcL LB medya 5ml için transfer (U 1000) ve 37 gece sallayarak ° C 225 rpm'de aerobik büyüdü .
2. 24 saat sonra doymuş kültürünün 500 mcL 500 ml LB medya içine transfer edilir ve 37 ° C inkübatör sarsılmış 5-6 saat için ek 250 mcL IPTG (İzopropil _-D-1-thiogalactopyranoside) ve başka bir inkübe 5-6 saat. IPTG lacZ gen ilgi ve IPTG gen ile değiştirilir lac operonunun, transkripsiyon gen ekspresyonu sonra ikna etmek için kullanılır tetikler bir laktoz metaboliti çünkü gereklidir.
3. Kültürü, daha sonra 12000 rpm'de 15 dakika boyunca yüksek hızda santrifüj soğutma bükülmüş ve süpernatantı atılır. Hücreler daha sonra 40 ml hacmi 1 gram başına bir pelet 10 ml dayalı olmalıdır CelLytic B (afinite saflaştırma ve analiz için uygun olan proteinlerin hızlı ve etkili ekstraksiyon CelLytic B sonuçları.) Yeniden süspanse. Merkaptoetanol, 28 ul hücre parçalama sonra ilgi proteinleri sindiren proteazlar devre dışı bırakmak için, disülfit bağları ve phenylmethanesulphonyl florür 400 ul kırmak için eklenir. Protein özleri hedefler için analizden önce aşağılamak olmadığını sağlamak için; "proteaz kokteyl" de (2 mg / ml tripsin inhibitörü 400 mcL 0.2 mg / ml, 0.2 mg / ml leupeptin pepstatin A. 400 mcL 400 mcL) eklenir çıkar. Daha sonra 400 mcL 1M imidazol ekleyin, 5 phosphodinucleotide ve oligonükleotid istenmeyen tek ve çift iplikli DNA aşağılamak için kullanılan DNaz I kromatografi sütun ve 1mm boncuk yüzeye bağlı Ni iyonları, bağlı etiketli proteinlerin Zehir için kullanılır parçaları.
4. Soğutma santrifüj 10000 rpm'de 60 dakika, 30 dakika boyunca buz üzerinde reaksiyon için yeterli bir süre, spin izin karanlıkta karışımı karıştırın. Süpernatant Hasat ve kromatografi için hazırlık olarak 3 dakika boyunca maksimum hızda mikrofuge'de santrifüj tüplerine iplik ve lizis tamponu ile yıkama, karışımın kadar eğirme ve yıkama tekrar Ni-NTA (Qiagen nikel nitrilotriacetic asit Superflow) infüzyon gerçekleştirmek Herhangi bir mavi tonu açık. Yavaş yavaş ortaya çıkan karışım, 60 dakika boyunca buz üzerinde karanlık bir kapta karıştırın.
5. Kolon kromatografisi 12 kesirler aşağıdaki gibi akan gerçekleştirin. İlk bölümü önceki adımda Ni-NTA ile karıştırılarak 10 ml süpernatant ile bir akış. Ikinci Lizis tampon 10 ml (50 mM Na-fosfat, 300 mM NaCl, 20 mM imidazol, pH 8.0), üçüncü 10 tampon mL (10 mM imidazol, 100 mM NaCl, pH 8.0), dördüncü ve geri kalanı elüsyon tamponu 0.5 ml (250 mM imidazol, 100 mM NaCl, pH 8.0)
6. SDS-PAGE poliakrilamid jel hazırlayın ve bir kısmını 4 mcL ve 5X SB (300mm Tris 6.8,% 25 Bme,% 10 SDS,% 50 gliserol) 1 mcL karıştırma numunesinin. Standart Invitrogen tarafından 100 kb DNA merdiveni kullandı. Yüklemeden önce 5 dakika boyunca örnekleri kaynatılır. Yükledikten sonra, 60 dakika için 120V jel koştu. Sonra, lekeli destained ve nihayet 80C az 2 saat için özel bir jel kurutma makinesi kurutulur.
7. Daha sonra jel sonuçları incelendi ve en iyi sonucu vermiştir kesirler yer. Bizim ilgi protein bağlı olarak, bantların bir proteinin büyüklüğü sırasıyla yer olmalıdır. Bu bölümü MonoQ Superdex 200 (Amersham Pharmacia) ile daha fazla protein saflaştırılması için seçilmiş olmalıdır.
8. Konsantrasyon, her zaman, 5 dakika boyunca 14 rpm'de gözenek boyutu 10K Nanosep filtre en yoğun kesirler iplik elüsyon tamponu ile yıkama yapılır. BSA tahlil daha fazla protein etiketleme prosedürü için kullanan son protein konsantrasyonu belirlemek için gerekli.
9. NLS-2xGFP içsel yeşil floresan fotoğraf istikrar yoksul ve hücre otofloresans ile çakışan spektrumu nedeniyle nükleer ulaşım tek molekül görüntüleme için kullanılan olamaz. Bu nedenle, biz TCEP tris (2 düşüldükten sonra 50 mM sodyum fosfat, 150 mM NaCl 2 saat boyunca oda sıcaklığında bir sistein-reaktif organik boya (Molecular Probes Alexa555 veya Alexa 647 maleimide) aşırı yük molekülleri etiket 20 dakika boyunca carboxyethyl). 2-merkaptoetanol Reaksiyonlar söndürülür ve protein çözümleri, ücretsiz boya kaldırmak için diyalize.

3. Tek molekül mikroskopi

1. Bizim mikroskop kurmak 1.4 NA 100x yağ immersiyon objektif (UPLSAPO 100XO, Olympus) ile donatılmış bir Olympus IX81, 35 mW 633 nm GFP filtre ile cıva lambası He-Ne lazeri (Melles Griot), bir çip çarpma kazanç şarj çiftli aygıt kamera (Cascade 128 +, Roper Bilimsel) ve thveri toplama ve işleme için e Slidebook yazılım paketi (Akıllı Görüntü Yenilikler). Optik bir kıyıcı (Newport) lazer uyarma bir on-off modu oluşturmak için kullanılır oldu. GFP ve Alexa647 floresan sırasıyla cıva lambası ve 633 nm lazer heyecanlıydı. Dikroik filtre (Di01-R405/488/561/635-25x36, Semrock) ve emisyon filtresi (NF01-405/488/561/635-25X5 filtre aynı amacı, yeşil ve kırmızı floresan emisyon toplanmıştır. 0, Semrock) ve benzer bir CCD kamera tarafından görüntülendi.
2. Tek molekül deneylerde, taşıma süresi daha uzun olması için tek bir kargo molekülün floresan photobleaching zaman olanak tanır. Photobleaching zamanı belirlemek için, 0.1 nM kargo molekülleri, non-spesifik emilim nedeniyle 30 dakika sonra kayma ve hareketsiz hale bir cam kapak kaplanmıştır. Sonra, floresan zaman ders ölçülür. Faiz photobleach kez protein bağlı olarak, bu nedenle, aydınlatma şiddeti ve aydınlatma alanında maleimides ile reaksiyona yetenekli cysteins sayısına göre farklı olacaktır, bir ön photobleaching neden ayarlanabilir olmalı ve Alexa 647 ekran etiketli yükün molekülleri sigorta kargoların NPC'ler ile etkileşime daha uzun floresan.
3. Permeabilize hücreleri ithalat deneyler için, kargo ve temel taşıma kofaktör birlikte ilave edilmiştir. Tipik ithal kargo reaksiyonları 1 mM GTP, 0.5 mcM içerdiği Importin, 0.5 mcM Importin-1, 2 mcM Ran ve pasif taşıma için 10KDa Dextran'ın kolaylaştırılmış taşıma ve 0.1 nM 1 mcM NTF2 .. Floresan kargo konsantrasyonları toplu deneylerde> 100 nM, ve tek bir molekül deneyleri için 100 pM ~. Bu konsantrasyonlarda, kargo% 99 Importin ve Importin komplekslerini oluşturmak için bekleniyor. Ulaştırma oranı Epifloresans (sadece nispi oranları önemli olsaydı) veya konfokal floresan mikroskobu (mutlak oranları istenilen olsaydı) tarafından takip edildi.
4. İlk nükleer zarfın konumunu GFP filtreler NE bir resim çekmek için bir dizi ile ilgi çekici bir HBO cıva lambası, geniş alan Epifloresans mikroskobu ile tespit edilmiştir. Bir satır veya sütun içinde piksel yoğunlukları yaklaşık dik NE Gauss ile uygun. Piksel yoğunlukları belirli bir kümesi için Gauss tepe pozisyonlarda o satır ve sütun için KD konumunu kabul edildi. Gibi Gauss bir dizi tepe pozisyonlarda daha sonra tüm görüntü içinde KD yolunda verimli bir ikinci derece polinom uygun.
5. KD lokalize sonra tamamen photobleached kadar, 633 nm He-Ne lazer kullanan tüm otofloresans kurtulmak için çok önemlidir, genellikle üzerinde 60 saniye yeterli olacaktır.
6. Örnek molekülleri sonra PVP% 1.5 çözümü tutulacak ve karışımın hacmi 25 L akış odasına eklenen ve daha sonra filtre kağıdı bir fitil uygulayarak haznesinden sürükledi. Odak herhangi bir kuvvetli hareket tarafından kolaylıkla bozulacak çünkü mutlak bir bakım, doğru çekirdek zarı localisation sonra permeabilize hücrelere ithalat kargo proteinlerin yanı sıra üzerine alınmalıdır.
7. En kısa sürede kargo moleküller, He-Ne lazer moleküllerin transit taşımacılık yörüngeleri aydınlatmak için kullanılan 633 nm eklenir. Optik bir kıyıcı (Newport), yüksek güç yoğunluğu, lazer gibi olmayan photobleached tek moleküllerin bir bölümü NE yaklaşmasına izin photobleaching nedeniyle önlemek için yaklaşık 5 Hz'de meşgul olmalıdır. 2500 Hz kadar gidebilir yüksek hızlı CCD kamera ile çekilen videoların tek bir molekül translokasyonlar bir dizi olmalıdır.

4. Temsilcisi sonuçları

Doğru şekilde gerçekleştirilmemesi, protokol bize bir dizi permeabilize HeLa POM 121 hücrelerde nükleer gözenek kompleksi ile etkileşim tek kargo moleküllerin translokasyon gösteren videolar toplamak için izin verdi. (Şekil 1). Biz görüntü için yola çıkan ve stably GFP-POM121 ifade digitonin permeabilize HeLa hücreleri NPC ile dekstran moleküllerin geçici taşıma adımları izlemek. Hücreler etiketli dekstran moleküllerin düşük konsantrasyonlarda ile inkübe edildi. Çekirdeğin ekvator düzleminde bir 488-nm cıva lambası ışığı tarafından heyecan GFP floresan yeşil halka açık bir görüntü ile odak noktası haline getirilmiştir. GFP-KD uzun süre maruz kalma NE orta düzlemine yerelleştirmek mükemmel bir sinyal-gürültü (SNR) oranı elde etmemizi sağlar. Daha önce 10 kDa dekstran molekülleri, 500 ya da 1000 Hz'lik bir algılama kare hızı yaklaşık 20-40 mil mekansal çözünürlükte yaklaşık 2 ms içinde KD ile diffüz bulundu. Böyle bir uzaysal çözünürlük, pasif difüzyon için daha uzamsal bilgiyi açıklamak için yeterli değildir NPC aracılığıyla sadece dekstran moleküllerin 01:59 difüzyon adımları yakalamak sağlar. NPC içinde dekstran moleküllerin daha ince adımları yakalamak için daha iyi bir spati2500 Hz daha hızlı bir algılama kare hızı daha ince difüzyon adımları yakalamak için uyarlamak için; (i) ve (ii) daha yüksek bir aydınlatma optik yoğunluk elde etmek için tek moleküllerin daha fazla fotonlar heyecanlandırmak için istihdam için: otemporal çözünürlük, biz iki önemli iyileştirmeler yaptık yüksek uzaysal çözünürlük. Bu gelişmeler bize bir uzaysal çözünürlüğe sahip 12 nm ve 400 ms, 100 kW / ^cm 2 radyasyonunun az 633 nm lazer ışığı NE genelinde alexa647 etiketli dekstran molekülleri geçici difüzyon birden fazla adımları yakalamak için olanak sağlar .

Şekil 1'de gösterildiği gibi, dekstran moleküllerin tipik ulaşım olayların bir dizi hareketsiz görüntü kaydedildi. Bireysel transit dekstran moleküllerin uzaysal yörüngeleri takip ederek, KD aracılığıyla difüzyon ince adımları ayırt edildi. Biz yaklaşık% 30 KD ile etkileşim olaylar kaynaklanan ve hedef bölmeleri kabul etmiş olduğu bulundu. Sitoplazmaya KD hareket dekstran moleküller, aralarında iki hedef var: NE aracılığıyla difüzyon sonra çekirdeğinde sonu veya ihracat olaylar için benzer durumlar meydana KD ile etkileşim sonra sitoplazmaya geri dönmek: çekirdeğin başlayarak dekstran molekülleri sitoplazma girmek veya KD ile etkileşim sonra çekirdeğine geri diffüz. Böyle bir görüntü serisi NPC ile ilgili olarak, NPC aracılığıyla moleküllerin bekleme süresi gibi zamansal bilgileri ile tek moleküllerin uzaysal konumu hakkında bilgi içerir. NE alanı çevresinde dekstran moleküllerin yörüngeleri analiz ederek, taşıma süresi, verimlilik ve giriş frekansı tespit edilebilir. Işimizde taşıma süresini ithalat veya ihracat süresi olarak tespit edilebilir. Bunlar ortalama ithalat veya ihracat geçiren NPC'ler içinde dekstran moleküllerin bekleme süresi olarak tanımlandı. Ithalat veya ihracat verimliliği tam bir ithalat veya ihracat olayları tam ve prematüre olayların toplamı üzerinden yüzde olarak tanımlanmıştır. Ithalat veya ihracat giriş frekansı, bir saniye boyunca KD ile etkileşen moleküllerin sayısını ifade eder.

Şekil 1 KD aracılığıyla dekstran moleküllerin tipik ulaşım olayların seçilen video kareleri. (A) sitoplazma-to-çekirdek olay. Tek bir dekstran molekülü (kırmızı nokta), KD (yeşil piksel hattı) ile etkileşim, sitoplazma başladı ve çekirdeğinde sona erdi. Olay (mavi çizgiler ve açık noktalar) yörüngeleri belirlenir ve KD (siyah çizgi) ile üst üste. Yeşil ve kırmızı çizgiler, sitoplazma ve nükleer yan KD 100 nm-mesafe temsil eder. C, sitoplazma. N, çekirdeği. Ölçek çubuğu: 2 mm. (B) sitoplazma-sitoplazma olay. (C) çekirdeği-to-çekirdek bir olay. (D) çekirdeği-sitoplazma olay.

Discussion

Bakım Deney sırasında, KD ve tek moleküllerin uygun bir ko sigorta alınmalıdır. Sinyal düşük kötü etiketleme veya photobleaching nedeniyle, özellikle yüksek sinyal gürültü oranı sağlamak için de önemlidir. Yerelleştirme hassas arka plan gürültüsü (out-of-focus floresan, CCD okuma gürültü, karanlık ve diğer faktörlerden kaynaklanan) ile sınırlıdır.