Summary
에서 내부와 외부 세포막을 분리를위한 프로토콜
Abstract
Francisella tularensis는 그람 음성 세포 coccobacillus와 zoonotic 질병 tularemia의 원인이되는 에이전트이다. 다른 세균성 병원균, 매우 낮은 전염성 선량 (<10 CFU), 신속한 질병의 진행, 높은 병적 상태와 사망률 요금은 Francisella의 악성 변종이 소설 독성 요소를위한 인코딩하는 것이 좋습니다 비교하면. 표면 노출 분자, 즉 외부 멤브레인 단백질 (OMPs)은 세균의 호스트 바인딩 세포, 항목, 세포 생존, 독성 및 면역 회피을 촉진하기 위해 표시되었습니다. OMPs을 공부에 대한 관련 성은 더 이상 그들은 세균성 질병의 숫자에 대한 보호 백신으로 사용할 수있다는 사실에 의해 강조합니다. OMPs는 원심 분리 및 / 또는 세제 추출 다음 세포의 sonication을 포함한 대량 막 추출 기술을 통해 그람 음성 박테리아에서 추출 수있는 반면에, 이러한 준비는 종종 periplasmic 및 / 또는 세포질 (내부) 멤브레인 (IM) 오염 물질로 오염된 있습니다. 년 동안, 그람 음성 메신저와 외부 세포막의 생화학과 biophysical 분리의 "금 표준"방법 (OM) 자당 농도 구배 원심 분리에 의해 다음, spheroplasting 및 삼투 용해에 따라 박테리아되었습니다. 일단 자당 기울기에 겹쳐, OMS는 낙관적인 밀도의 차이에 따라 인스턴트 메시지에서 분리 크게 OM에서 lipopolysaccharide의 존재 (LPS)에 predicated 것으로 수 있습니다. 여기, 우리는 추출 풍부하게, 그리고 F.을 분리하기 위해 엄격한하고 최적화된 방법을 설명 tularensis 외부 세포막과 관련 OMPs.
Protocol
1 일 : F. tularensis 플레이트 접종
- F.의 플레이트 냉동 재고 문화 뮬러 - 힌턴 한천에 tularensis 2.5 % (권 / 권) 기증자 송아지 혈청, 2 % (권 / 권) IsoVitaleX, 0.1 % (WT / 권) 포도당, 그리고 0.025 % (WT / 권) 철 나트륨과 보충. F. 그로 ° C 5 % CO 2와 함께 약 24 H. 위해 37 tularensis
일 2 : F. tularensis 액체 미디어 접종
- 양이온 - 조정 뮬러 - 힌턴 매체 (1.23 MM의 염화칼슘 이수화물 및 1.03 MM의 마그네슘 염화 hexahydrate을 포함) 1 리터 준비하고 압력솥. 37 냉각하면 ° C, 0.1 % (WT / 권) 포도당, 0.025 % (WT / 권) 철 나트륨, 2 % (권 / 권) IsoVitaleX 대한 추가 보완 매체. 이 500 ML의 aliquots로 (0.22 μ) 소독 매체를 필터링합니다.
- 멸균 50 ML 팔콘 튜브에 보충 뮬러 - 힌턴 매체 및 전송 12 ML를 제거합니다.
- 멸균 10 μl 접종 루프를 사용하여, F.의 큰 loopful을 다쳤어요 뮬러 - 힌턴 중간 (단계 2 참조) 12 ML에 한천 플레이트 (1 일 이상) 및 전송 박테리아에서 tularensis 성장. 피펫 솔루션을 여러 번 대단히 짧은 시간을 헤어지게하고 동질적인 박테리아 정지를 준비합니다. 와동하지 마십시오.
- 멸균 피펫을 사용하여 3 단계에서 세균 현탁액의 5 ML 각 500 ML 선박의 예방. 37 국물 문화를 성장 ° C 부드러운 흔들림 (뉴 브 런 즈윅 이노바 2300 시리즈 쉐이크에 190-200 RPM)를 14-18 H하십시오.
3 일 : Spheroplasting, 삼투 용해 및 자당 농도 구배 원심 분리
- F.를 구합니다 tularensis의 흔들림이 인큐베이터에서 문화는 각각의 광학 밀도를 확인 각 500 ML 문화 1 - ML 나누어지는를 제거합니다. F.를 사용할 때 우리는 최적의 멤브레인 추출 및 절연 결과를 발견 0.2 사이 0.4 (~ 10월 7일에서 10월 8일까지 CFU / ML)로 OD 600과 상호 성장의 초기 단계에 로그 tularensis 세포. 0.2 이상의 OD 600 적은 비용으로 문화는 이후 자당의 그라디언트에 대한 총 멤브레인 소재의 충분한 수량을 얻을 수 없습니다. 반대로, 0.4 (고정 단계를 근접)보다 OD 600 이상과 문화가 혼합 막 fusions를 얻을 것으로되었습니다.
- 15 30 분 7,500 X g에서 문화를 원심 분리기 ° C는 세포를 수집합니다. 그것이 이후 펠렛 서스펜션을 용이하게하기 때문에 우리는, 넷 250 ML의 원심 분리기 병의 문화의 원심 분리하는 것이 좋습니다.
- 조심스럽게 각 원심 분리기 병에서 미디어 표면에 뜨는를 제거하고 단단히 초과 성장 매체를 제거하는 흡착제에 병을 누릅니다.
- 원심 분리의 10 분 이내에 다음과 같은 완성, 0.75 M의 자당 (5 MM 트리스, 산도 7.5의)의 8.75 ML 각 박테리아 펠렛을 일시 중지합니다. 이들 네 박테리아 쥐똥이 일시 중지하고 10 분 이내에 살균 250 ML 플라스크 (작은 stirbar로)로 (세균성 정지 35 ML 총) 양도해야합니다.
- 부드럽게 stirplate에 세포 현탁액을 혼합하는 동안, 천천히 10 분 과정 10여 MM 나트륨 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 70 ML (2 볼륨) (5 MM 트리스, 산도 7.8)을 추가합니다. EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 높은 지방 농도를 피하기 위해 세포 현탁액 수준 아래 피펫의 끝에있는 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션을 추가합니다. stirbar 철저하게 얼굴이 볼만 또는 버블 형성 원인만큼 빠른 세포 현탁액을 혼합 아니라 충분한 속도로 회전해야합니다. EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션이 추가되었습니다 후, 실온에서 30 분 솔루션을 품어.
- 30 분 부화 후, 천천히 200 μg / ML의 최종 농도 2 MG / ML 라이 소 자임 솔루션 11 ML (1 / 10 일 볼륨)을 추가합니다. 라이 소 자임 솔루션뿐만 동안 세포 현탁액을 섞어 계속합니다. 위에서 바와 같이, 라이 소 자임의 높은 지방 농도를 피하기 위해 세포 현탁액 유체 수준 아래에 피펫 팁과 라이 소 자임 솔루션을 추가합니다. 주식 라이 소 자임 솔루션 (2 MG / ML) 단일 사용 aliquots에서 준비하고 3~4개월위한 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. 실온에서 30 분 결과 솔루션을 품어.
- 30 분 동안 부화, 작은 stirbar 룸 온도 Cellgro 분자 학년 DH 2 O (4.5 권)의 530 ML과 멸균 1L 플라스크를 준비합니다.
- Osmotically 부드러운 혼합과 10-15 분 과정을 통해 분자 학년 DH 2 O (7 단계에서)의 530 ML에 느린 희석 (약 11 ML / 분 유량)의 세포 현탁액을 (6 단계에서) lyse. 때문에이 단계에서 큰 솔루션 볼륨의 적절한 혼합을 보장하기 위해 stirbar 속도를 향상시킬 수 있습니다. stirbar 얼굴이 볼만 또는 버블 형성으로 이어질 정도로 빠르게하지 철저하게 세포 현탁액을 분산하기 위해 충분한 한번 DH 2 O에 추가 속도로 회전하지만해야합니다. 셀의 균일한 희석을 촉진하기 위하여, 피펫의 끝은 stirbar에 인접한 술병의 바닥에 휴식과 세포 현탁액을 추가내 현탁액. 우리는 25 - ML의 pipettes이 단계에서 가장 잘 작동 것으로 나타났습니다. 조심스럽게 희석 과정을 모니터하고 유속 세포, 세포 대단히 짧은 시간, 그리고 세포 가닥의 로컬 쌓일 해산하기 위해 필요를 방해. 실온에서 30 분 결과 솔루션을 품어. 이 단계가 가장 도전적이고 실험의 전반적인 성공에 중요한 중 하나 나타납니다.
- 30 분 부화 후 10시 30 분 7500 XG 50 - ML 원뿔 튜브와 원심 분리기로 삼투 용해 용액 40 ML aliquots를 전송 ° C가 그대로 세포와 이물질을 제거합니다.
- 원심 분리 후, 조심스럽게 멸균 1L 플라스크에 각 원뿔 관 및 수영장 supernatants에서 뜨는의 27-30 ML을 제거
- 4 2 H에 대한 200,000 X G (F50L - 8x39 FiberLite의 초원 심 분리기의 회전자에 44,400 RPM) ° C. 16 초원 심 분리기 튜브와 원심 분리기로, 각각 풀링 뜨는 25 ML을 전송 각 로터 8 튜브를 보유하고 있습니다,이 단계 두 로터 두 ultracentrifuges 필요하므로. 또한, 8 튜브의 두 번째 세트 centrifuged ° C까지 4에서 개최한다.
- 초원 심 분리기 실행의 완성 10 분 이내에 멤브레인 resuspension 버퍼를 수정할 준비를합니다. 멸균 튜브에 막 중지 버퍼 8 ML (25 % [WT / WT] 자당, 5 MM 트리스, 30 MM MgCl 2) 전송 및 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - 무료 테아제 억제제 칵테일과 Benzonase의 375 U 1 타블렛을 추가합니다. 부드럽게 테아제 억제제의 정제를 해산하기 위해 솔루션을 섞는다.
- ultracentrifugation에 따라 신중하게, supernatants를 부어 흡착제에 초원 심 분리기 튜브를 반전하고, 단단히 초과 뜨는을 제거하기 위해 튜브를 누릅니다. 시각화에 도움을 마커 각 막 펠렛의 위치를 표시합니다. 부드럽게 600 μl 수정 막 resuspension 버퍼의 각의 8 멤브레인 알약을 resuspend. 부드럽게 멸균 튜브에이 여덟 산탄, 그리고 수영장 결과 멤브레인 resuspensions을 resuspend 여덟 튜브의 다음 세트 각 막 resuspension을 전송합니다. 그것이 멀리 튜브의 벽에서 필스 때까지 pelleted 점막이 resuspend하기 어려운되므로, 펠렛을 통해 수정된 막 resuspension 버퍼를 통과 계속합니다. 그것은 종종 resuspension 과정에서 튜브 벽 및 원조에서 멤브레인 펠렛를 긁어 micropipette 팁을 사용해야합니다. pipetting 때, 얼굴이 볼만 피하거나 거품이 형성. 이 단계가 가장 도전적이고 실험의 전반적인 성공에 중요한 중 하나 나타납니다.
- 멤브레인 알약이 resuspended 모든 16 튜브에서 제거된 경우, 수정된 멤브레인 resuspension 버퍼 600 μl와 매 4 튜브를 씻으십시오. 세척은 각 튜브의 표시 영역 (막 펠렛) 주변에 집중해야합니다. 막 resuspension 튜브로 세척을 전송합니다. 네 튜브의 나머지 세 세트를위한 세척 단계를 반복합니다.
- 응집 물질의 감소에 DNA와 도움을 손상시키고 실온에서 30 분 부드러운 락을 함께 막 resuspension을 품어.
- 막 현탁액의 작은 나누어지는을 제거하고 전체 멤브레인 수율을 결정하는 단백질 부량을 수행합니다. 우리는 일반적으로 undiluted 준비, 1:1 (2.5 % SDS)을 희석하고, 1시 3분 90시 (2.5 % SDS)를 막 샘플, 열 샘플을 희석 ° 10 분, 그리고 수치 BioRad DC의 단백질 분석을 사용하기 위해 C 막 resuspension 단백질 농도. 총 단백질 수율 1.0 MG / ML 1.6 MG / ML 사이에 일반적으로있다. 열과 SDS의 사용은보다 정확한 단백질 부량 값을 얻을 수 있도록 압축이 풀린 세포막에서 OMPs을 해제해야합니다.
- 55%, 50 %, 45 %, 다음 순서대로 14 X 95mm 울트라 클리어 초원 심 분리기 튜브로 겹겹이 1.8 ML 자당 솔루션의 각 (WT / WT, 5 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 7.5의 준비)에 의해 선형 자당의 그라디언트 준비 40 %, 35%, 30 %. 자당의 그라디언트의 겹겹이는 전구의 pipettor 아니라 자동 pipettor를 사용할 때 수행하는 가장 쉬운 방법입니다.
- 막 resuspension 단백질 양을 정함 (단계 16), 레이어의 각 그라디언트 위에 막 resuspension 1.5 MG에 따라. 각 14 X 95mm의 초원 심 분리기 튜브는 10.8 ML은 단계 17에서 자당 솔루션에 의해 차지하는 것을 주어진 최대 12.5 ML의 용량과를 가지고, 당신은 그라디언트마다 막 resuspension 이상의 1.7 ML를 로드할 수 없습니다. 모든 튜브는 (± 0.01 g) 같은 무게 때문에 각 자당 기울기 관의 마지막 무게를 (막 resuspension를 추가하거나 제거하여) 개별적으로 무게와 신중하게 조정합니다.
- 4 17 H 최소 256,000 X G (38,000 RPM) ° C.에서 SW - 40Ti 스윙 버킷 로터와 원심 분리기에 자당의 그라디언트를 전송
주 4 : 자당 기울기 분수 수집
- 원심 분리 17 H 후, 원심 실행을 중지하고, 조심스럽게 SW - 40Ti의 회전자에서 자당의 그라디언트를 제거합니다.
- 70 % 에탄올로 자당 기울기 튜브의 아래쪽, 바늘을 조심스럽게 청소21g 바늘로 튜브의 아래쪽, 그리고 무균 microfuge 튜브에 그라디언트에서 순차 500 μl 분수를 수집합니다. 이후 그라디언트에 대한 반복합니다. 기울기가 중력의 흐름에 의해 똑 수 있어야하므로 같은 자당 기울기를 방해하지 않습니다. 흘리지는 그라디언트 튜브의 바닥에서 멈추면 경우, 압력 소량 하나의 손가락을 사용하여 튜브의 상단에 적용할 수 있습니다.
- 굴절계를 사용하여 각 자당 기울기 분율의 굴절률을 결정하고 G / ML 1 특정 밀도 굴절률을 상관 관계. nitrocellulose로 전송, SDS - PAGE 분리, 그리고 immunoblotting, 대표 자당 기울기 분수 (1.11에서 G / ML 1.26 G / ML에 0.01의 밀도 증가)을 준비하여 단백질 지방화을 평가합니다.
대표 결과
두 종류의 메신저와 OM의 vesicles의 완전한 분리에 제대로 수행이 절차 결과 (예 : SchuS4)과 B 타입의 F. (예 : LVS) 종자 tularensis. 그림 1, F. 대표 immunoblots에 표시 tularensis의 OMPs는 1.17 및 1.20 g / ML의 밀도 사이에 집중. 비교함으로써, IMPs는 1.13 및 1.14 g / ML의 밀도 사이에 집중.
그림 1. F.의 Immunoblotting tularensis의 자당 밀도 기울기. 연속 분수는 그라디언트와 밀도 (g / ML) 굴절 지수에 기초하여 계산되었다에서 수집되었다. 단백질은 SDS - PAGE로 구분하여 nitrocellulose로 전송하고, OMP 그리고 IMP 분별 (분리)을 감지 immunoblotted했다. MW는 크기 (KDA)를 각 얼룩의 왼쪽에있는 언급과 분자량 표준을 prestained. F.의 LVS, 전체 세포 lysates tularensis의 LVS. 해당 자당 기울기 분율의 밀도는 각각의 차선 위에 설명되어 있습니다. 로 왼쪽 여백에 명시된 바와 같이 OMPs와 IMPs는, polyclonal, monospecific antisera과 함께 발견되었다. 비슷한 결과는 F.에 대한 취득했다 tularensis SchuS4.
Discussion
이 프로토콜은 spheroplasting, 삼투 용해의 변화 및 기타 세포 구성 요소 2, 3, 4의 물리적 분리 및 그람 음성 세균 OMS의 농축에 대한 자당 밀도 기울기 원심 분리 "금 표준"을 설명합니다. 우리는 이전에 두 종류의 OMS를 분리를위한이 방법의 응용 프로그램을 설명하는 반면 F.의 A와 타입 B의 종자 tularensis 5, 프리젠 테이션은 OM 격리에 대한 자세한 최적화 절차를 제공합니다. 사실, 이것은이 치명적인 병원균의 잠재적 표면 노출과 추정 독성 요인을 식별에 중요한 발전이다. 이 절차의 중요성은 악성 타입 F.에 대한 실질적인 보호를 여유 정화 OMPs과 생쥐의 예방 접종을 보여주는 우리의 실험실에서 연구에 입증되었다 tularensis 폐 도전 6. 세균성 세포 삼투 용해 중에주의 모니터링 및 멤브레인 알약의 부드러운 resuspension의 위에 바와 같이, 성장 단계는이 막 분리 절차의 성공 / 실패와 연관시키는 것은 나타나지 중요한 단계입니다. 이 최적화 방법은 엄격한 일부 실험적인 변화에 따라 달라질 수 있지만, 결과 OMS는 세제의 사용, 염화 리튬이나 나트륨 탄산 7, 8, 9, 10, 11 얻고 사람에 비해 현저하게 향상된 순결이 될 것처럼, 12.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
설명이 프로젝트는 부여 번호 NIAID / NIH에서 P01 AI055637와 U54 AI057156 지원했다. 그 내용은 전적으로 저자의 책임이며, 반드시 경찰과 프로그램 사무실, NIAID, 또는 NIH의 공식 견해를 대변하지 않습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Donor calf serum | Mediatech, Inc. | 35-022-CV | |
| IsoVitaleX | BD Biosciences | 211876 | |
| Cellgro molecular grade dH2O | Mediatech, Inc. | 46-000-CM | |
| 38.5 ml polycarbonate bottle | FiberLite | 010-0514 | |
| F50L-8x39 ultracentrifuge rotor | FiberLite | 096-087051 | |
| Complete mini EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche Group | 04693132001 | |
| Benzonase | Novagen, EMD Millipore | 70664-3 | |
| DC protein assay | Bio-Rad | 500-0116 | |
| Ultra-Clear 14x95mm centrifuge tubes | Beckman Coulter Inc. | 344060 | |
| SW-40Ti swinging bucket rotor | Beckman Coulter Inc. | 331301 | |
| Abbe benchtop refractometer | Fisher Scientific | 13-964-10 |
References
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