Summary
وصفت وسيلة سريعة للحصول على نظرة ثاقبة لبنية السكريات في المصفوفة خارج الخلية. الأسلوب يستفيد من خصوصية وحساسية glycosylhydrolases من مطياف الكتلة يسمح تحليل كميات ضئيلة من المواد. هذا الأسلوب هو قابل للتكيف لاستخدامها مباشرة على النسيج نفسه.
Abstract
وتوسط في اتصال مباشر من الخلايا للبيئة في العديد من الكائنات الحية عن طريق المصفوفة خارج الخلية. جانب واحد مشترك للمصفوفات خارج الخلية هو أنها تحتوي على جزيئات السكر معقدة في شكل جليكوبروتينات ، البروتيوغليكان ، و / أو السكريات. وتشمل الأمثلة على المصفوفة خارج الخلية من البشر والخلايا الحيوانية التي تتألف أساسا من البروتينات الليفية والبروتيوغليكان أو الجدران السكاريد خلية تقوم النباتات والفطريات ، وبروتيوغليكان / شحمي سكري جدران الخلايا تقوم البكتيريا. كل هذه glycostructures تلعب دورا حيويا في الخلية الى خلية الاتصال والخلية الى البيئة والإشارة.
مثال استثنائية معقدة من مصفوفة خارج الخلية موجودة في جدران خلايا النباتات الراقية. جدار مصنوع بالكامل تقريبا من السكريات ، وتصل إلى 75 ٪ من الوزن الجاف ، وتتكون من البوليمرات الحيوية الأكثر وفرة موجودة على هذا الكوكب. لذا ، يجري ابحاثا حول كيفية استخدام هذه المواد أفضل كمورد خالية من الكربون ليحل محل البتروكيماويات المتجددة المستمدة من الوقود الأحفوري. التحدي الرئيسي لتحويل الوقود لا يزال تمردات الجدران لتدهور الأنزيمية أو كيميائية بسبب glycostructures فريدة موجودة في هذا biocomposite فريدة من نوعها.
هنا ، نقدم طريقة لتحليل سريع وحساسة من glycostructures جدار الخلية النباتية. ويستند هذا الأسلوب الشامل أليغو التنميط (OLIMP) الافراج الأنزيمية من oligosaccharides من مواد الجدار تسهيل glycosylhydrolases محددة والتحليل اللاحق للمخاليط oligosaccharide solubilized باستخدام مصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز / التأين وقت الرحلة الكتلة الطيفي (MALDI-TOF/MS ) 1 (الشكل 1). OLIMP يتطلب جدران الخلايا فقط 5000 لتحليل كامل ، لا يمكن أن يؤديها على النسيج نفسه 2 ، وغير قابلة للتحلل عالية الإنتاجية 3. بينما لا يمكن أن المبلغ المطلق للoligosaccharides solubilized يحددها OLIMP أن يرسم الوفرة النسبية للايونات في oligosaccharide مختلفة من الأطياف الشامل يعطي أفكارا حول نمط بدائل للالسكاريد الأصلية موجودة في الجدار.
يمكن استخدامها لتحليل OLIMP تشكيلة واسعة من البوليمرات الجدار ، وقلة فقط من توافر إنزيمات معينة 4. على سبيل المثال ، لتحليل البوليمرات الموجودة في جدار الخلية النباتية الانزيمات المتوفرة لتحليل xyloglucan hemicelluloses باستخدام xyloglucanase 5 ، 11 ، 12 ، 13 ، xylan باستخدام 6،7 إندو - β - (1-4) ، xylanase أو للحصول على السكريات بكتيني باستخدام مزيج من polygalacturonase وmethylesterase 8. وعلاوة على ذلك ، يمكن استخدام نفس مبادئ glycosylhydrolase OLIMP والأنشطة ناقلة الغليكوزيل حتى يتم رصدها وتحديد 9.
Protocol
ويتمثل الأسلوب OLIMP على هيميسيلولوز الرئيسية الموجودة في جدران الخلايا النباتات dicot ، xyloglucan ، وذلك باستخدام endoglucanase كما glycosylhydrolase. ويتجلى الأسلوب مع الشتلات Arabidopsis بأسرها مصنع النسيج المصدر. يمكن أن تكون بديلا عن الانزيمات والمواد المصفوفة خارج الخلية اعتمادا على التحليل المطلوب باستخدام نفس الإجراء.
1. جدار الخلية العزلة
- حصاد five 5 أيام القديمة الشتلات Arabidopsis كليا أو ما يعادل ذلك من المواد التي تريدها ونقلها إلى أنبوب 1.5mL رد فعل. تأكد من أن يتم وضع هذه المادة في الجزء السفلي من الأنبوب.
- إضافة اثنين من كرات معدنية 3mm ل الأنبوب رد فعل على أعلى من العينة والمفاجئة التجميد في النيتروجين السائل.
- طحن العينة المجمدة باستخدام الكرة مطحنة (2:30 دقيقة ، 25Hz).
- إضافة 1mL الإيثانول المائي 70 ٪ من العينة. إزالة الكرات المعدنية باستخدام المغناطيس. دوامة بدقة.
- أجهزة الطرد المركزي في العينة 14000 دورة في الدقيقة ل10min لتكوير بقايا الكحول التي تحتوي على مواد غير قابلة للذوبان جدار الخلية.
- إزالة بعناية طاف بواسطة الطموح. تأكد من عدم تعكير صفو بيليه.
- إضافة 1mL من كلوروفورم / الميثانول (1:1 V / V) حل. دوامة جيدا لresuspend الكرية.
- أجهزة الطرد المركزي في 14000 دورة في الدقيقة العينة لمدة 10 دقيقة وإزالتها بعناية طاف بواسطة الطموح. تأكد من عدم تعكير صفو بيليه.
- جفاف العينة باستخدام مكثف.
2. Solubilization من oligosaccharides
- لsolubilization resuspend السكاريد وخاصة في شكل oligosaccharides أعمالها بيليه الجافة في 25μl لالعازلة المناسبة. لفورمات الأمونيوم 50mM endoglucanase ، pH4.5 ، يستخدم. إضافة 0.2U من endoglucanase. وقف دوامة والسائلة تدور باستمرار.
- نموذج لاحتضان 16H في 37 في حاضنة درجة مئوية ، والهز في 300rpm.
- إزالة المذيب للهضم (المياه) باستخدام مكثف.
3. MALDI - TOF تحليل صدر oligosaccharides
- وتستخدم BioRex الموجبة 501 MSZ الخرز راتنج تبادل لإزالة الأملاح والانزيم من العينة هضمها. شرط حبات عن طريق وضع قسامة في عمود فارغ وغسل الخرز مع كميات وفيرة من المياه.
- إضافة إلى 50-10 الخرز BioRex العينة هضمها والمجففة. ثم يضاف الماء 10μl ، ليمكن استخدام كميات صغيرة من المواد 5μl من الماء. تزج حبات في حل عن طريق الدوران لفترة وجيزة في الأنبوب. احتضان لمدة لا تقل 10min في درجة حرارة الغرفة.
- بقعة 2μl مصفوفة (2،5 - dihydroxybenzoic حمض (DHB) ، 10mg/ml في الماء) على لوحة الهدف MALDI. تتبخر المذيبات المصفوفة تحت فراغ يؤدي إلى بلورات متجانسة الكيميائية المصفوفة.
- 2μl بقعة من الحل عينة المحلاة على رأس الكريستال مصفوفة على لوحة الهدف.
إذا كنت ترغب في بقعة عدد كبير من العينات تبقي فقط على اكتشاف لمدة أقصاها 3min. هذا الإطار الزمني يضمن أن العينة الأولى رصدت لم يجف بعد. الانتظار للحصول على 2min إضافية لضمان وجود خلط دقيق لإعادة حل المصفوفة وجزيئات عينة oligosaccharide في العينة رصدت الماضي. الجافة ثم لوحة الهدف في ظل الفراغ.
وينبغي أن المزيج عينة / مصفوفة بلورة في أقل من لتمكين 1min تبلور متجانسة. - مكان لوحة الهدف في مطياف الكتلة - TOF MALDI. يجب تعيين الجهاز إلى وضع reflectron إيجابية مع الجهد المتسارع لل20000V وتأخير من 350 نانومتر ، ومجموعة مختارة الشامل ينبغي 500-3000 دا (قد تتغير اعتمادا على oligomers المتوقعة). بدء اطلاق النار ليزر وجمع أطياف 100-200 لكل عينة ، والتي هي ترجمة لتوليد طائفة ممثل المتوسط (الشكل 2A). يمكن التعرف على أيونات يمثل oligosaccharides محددة من كتلتها أكثر من نسبة (م / ض) تهمة. وينبغي أن يضاف شدة ايون (ارتفاع الذروة) لجميع الأيونات ذات الاهتمام تصل إلى 100 ٪ مما أدى إلى وفرة نسبية في كل oligosaccharide في العينة (الشكل 2B).
4. وفي تحليل OLIMP الموقع
ويمكن أيضا أن تستخدم OLIMP مباشرة على النسيج حذف أي خطوات إعداد الجدار. كما etiolated مثالا hypocotyls من Arabidopsis كما تستخدم مصدر الأنسجة النباتية. مرة أخرى ، يتم استخدام endoglucanase لتحديد هيكل xyloglucan hemicelluloses. يمكن أن تكون بديلا إنزيم الأنسجة والمواد اعتمادا على التحليل المطلوب باستخدام نفس الإجراء.
- محصول etiolated الشتلات ووضعه على لوحة فارغة الهدف MALDI وترك الشتلات الجافة.
- إضافة 0.5μl endoglucanase (0.4U/μl ، الذائبة في فورمات الأمونيوم 50mM ، pH4.5) على الشتلات المجففة في الموضع المطلوب. تأكد من أن انخفاض انزيم اللمسات جزئيا لوحة الهدف.
- مكان لوحة الهدف MALDI في حاوية مغلقة مع رطوبة تشبع لتجنب أن تراجع انزيم يجف. احتضان لوحة في قاعة : 16H عند 37 درجة مئوية.
- الجافة لوحة الهدف MALDI مع الأنسجة النباتية وانخفاض انزيم تحت فراغ.
- إضافة 0.5μl المصفوفة (DHB ؛ 10mg / لتر) على رأس كل بقعة انزيم المجففة. السماح لها الوقوف ل2min.
- الجافة لوحة الهدف MALDI تحت فراغ.
- تحليل عينات مع MALDI - TOF. مكان لوحة الهدف مع الأنسجة والبقعة انزيم / مصفوفة (ق) إلى مطياف الكتلة - TOF MALDI. يجب تعيين الجهاز إلى وضع reflectron إيجابية مع الجهد المتسارع لل20000V وتأخير من 350 نانومتر ، ومجموعة مختارة الشامل ينبغي 500-3000 دا (قد تتغير اعتمادا على oligomers المتوقعة).
- بدء اطلاق النار ليزر على بلورات المصفوفة / عينة NEXT إلى الأنسجة. تأكد من أنك لا تضغط على الأنسجة نفسها ، كما هو الحال في مثل هذه الحالة وقت الرحلة من الجزيئات سيتم إيقاف. جمع نحو 20-50 في بقعة الأطياف ، والتي هي ترجمة لتوليد طائفة ممثل المتوسط (الشكل 3). يمكن التعرف على أيونات يمثل oligosaccharides محددة من كتلتها أكثر من نسبة (م / ض) تهمة. يمكن الابلاغ عن شدة ايون (ايون الارتفاع) وينبغي أن تضاف أيونات كل من الفائدة تصل إلى 100 ٪ مما أدى إلى وفرة نسبية في كل oligosaccharides في العينة.
5. ممثل النتائج
ويرد مثال لتحليل OLIMP من xyloglucan hemicelluloses موجودة في Arabidopsis الشتلات في الشكل 2. ويمكن لوجود خلافات كتلة الأيونات وانزيم يعرف جيدا اتسم (endoglucanase) خصوصية يتم تعيين أيونات للهياكل محددة oligosaccharide (الشكل 2A). من الواضح ، لا يمكن أن تميز أيزومرات الهيكلي. الافتراض الأساسي لتحديد الوفرة النسبية لمختلف oligosaccharides (الشكل 2B) هو أن على الاستجابة المواصفات عامل الشامل هي مشابهة جدا لتلك oligosaccharides. كما هو موضح هنا ، والقياس الكمي OLIMP هو تكرار للغاية. ومع ذلك ، يرجى ملاحظة أن متانة الأسلوب يعتمد اعتمادا كبيرا على إشارة إلى نسب الضوضاء من الأيونات في oligosaccharide المختلفة. على سبيل المثال يمكن للتلوث مع أملاح أو كميات أقل من هذه النسبة انخفاضا oligosaccharides.
تحليل OLIMP على النسيج نفسه (في تحليل الوضع الطبيعي) تمكن من دراسة مناطق صغيرة ومحددة جدا وينطوي على القليل جدا من إعداد العينة. في المثال المقدمة هنا (الشكل 3) لا النوعي (الأيونات نفسها) ولكن لوحظ اختلاف كمي (التباين في كثافة الأيونات) بين الخضري والجذري الأنسجة من الشتلات Arabidopsis. ويمكن للطريقة التباديل - OLIMP بالتالي تؤدي الى "التصوير" الأنسجة.
الشكل 1. مخطط تدفق الإجراء OLIMP استخدام الشتلات Arabidopsis بأكملها كمصدر النبات. الأولى ، هي متآكلة الأنسجة والخلايا مواد الجدار مستعدة (صورة معدلة من فوجينو آخرون 10). ثم يتم الافراج oligosaccharides من السكاريد الجدار خاص باستخدام هيدرولاز محددة. أخيرا ، يتم تحديد الكميات المتوفرة النسبية للذوبان oligosaccharides باستخدام - TOF MALDI مطياف الكتلة.
الشكل 2. الوفرة النسبية للoligosaccharides xyloglucan في etiolated شتلة من Arabidopsis على النحو الذي يحدده OLIMP. أ) الممثل الطيف xyloglucan الشامل oligosaccharide ؛ كل أيون يمثل بنية محددة oligosaccharide ، لا يمكن أن تميز أيزومرات الهيكلي. ب) الرسم التخطيطي لشريط المقابلة من أجل تحديد الوفرة النسبية oligosaccharide.
الشكل 3. وفي تحليل OLIMP الموقع باستخدام الشتلات etiolated من Arabidopsis كمثال. ويمكن تحليل كل قطرة انزيم / الهضم (دوائر ملونة) بشكل مستقل ويمكن الحصول على أطياف الكتلة المقابلة وتحليلها.
الشكل 4. OLIMP طيف xylan هيميسيلولوز التي حصلت عليها هضم المواد Miscanthus نبات مع xylanase (Megazyme).
Discussion
الأسلوب OLIMP المعروضة هنا يمكن تحليل حساسة للغاية وسريعة للبوليمرات موجودة في مصفوفات خارج الخلية. OLIMP يجمع الافراج الأنزيمية من oligomers مع تحليل MALDI - TOF اللاحقة. الجيل طائفة - TOF MALDI تستغرق أقل من دقيقة واحدة ، وبالتالي OLIMP هو مناسبة لمجموعة واسعة من التطبيقات بما في ذلك دراسات الإنتاجية العالية مثل شاشات متحولة. لا يقتصر على OLIMP السكريات النباتية ولكن يحتمل أن يتم تطبيقها على مجموعة واسعة من البوليمرات ، وقلة فقط من توافر الإنزيمات حلمهي محددة. ومع ذلك ، وجود قيود OLIMP هو أنه لا يمكن مطلقا وفرة من البوليمر يمكن الحصول عليها.
كما ذكر من قبل ويمكن استخدام OLIMP لدراسة بنية مجموعة متنوعة من السكريات الموجودة في المصفوفة خارج الخلية من تنوع الأنواع. كمثال على ذلك ، الشكل 4 يمثل الطيف OLIMP هيميسيلولوز من الأنواع الرئيسية في العشب ، وxylan. هنا ، تم هضم المواد جدار الخلية المستمدة من العشب Miscanthus المعتدلة باستخدام xylanase.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل عن طريق منح OO0G01 طاقة معهد العلوم البيولوجية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,5-dihydroxybenzoic acid | Sigma-Aldrich | 37550 | 10mg/mL in water |
| BioRex MSZ 501(D) Resin | Bio-Rad | 142-7425 | |
| Endoglucanase | Megazyme | E-CELTR | |
| Xylanase M6 | Megazyme | E-XYRU6 | |
| 3mm metal balls | Retsch | 22.455.0011 | |
| Beat mill | Retsch | Mixer Mill MM400 | |
| MALDI-TOF | Shimadzu Corporation | Axima Performance | |
| MALDI target plate | Kratos Analytical | DE4555TA | |
| SpeedVac | Eppendorf | Vacufuge 5301 | |
| Vacuum manifold | EMD Millipore | MSVMHTS00 | |
| Vacuum pump | Welch Allyn | DryFast Ultra 2032 |
References
- Lerouxel, O. Rapid structural phenotyping of plant cell wall mutants by enzymatic oligosaccharide fingerprinting. Plant Physiology. 130 (4), 1754-1754 (2002).
- Obel, N. Microanalysis of plant cell wall polysaccharides. Molecular Plant. 2 (5), 922-922 (2009).
- Mouille, G. Quantitative trait loci analysis of primary cell wall composition in Arabidopsis. Plant Physiology. 141 (3), 1035-1035 (2006).
- Bauer, S. Development and application of a suite of polysaccharide-degrading enzymes for analyzing plant cell walls. PNAS. 103 (30), 11417-11417 (2006).
- Pauly, M. A xyloglucan-specific endo-beta-1,4-glucanase from Aspergillus aculeatus: expression cloning in yeast, purification and characterization of the recombinant enzyme. Glycobiology. 9 (1), 93-93 (1999).
- Aboughe-Angone, S. Cell wall carbohydrates from fruit pulp of Argania spinosa: structural analysis of pectin and xyloglucan polysaccharides. Carbohydr Res. 343 (1), 67-67 (2008).
- Brown, D. M. Comparison of five xylan synthesis mutants reveals new insight into the mechanisms of xylan synthesis. Plant Journal. 52 (6), 1154-1154 (2007).
- Lee, C. The PARVUS gene is expressed in cells undergoing secondary wall thickening and is essential for glucuronoxylan biosynthesis. Plant Cell Physiol. 48 (12), 1659-1659 (2007).
- Obel, N. Pectin may hinder the unfolding of xyloglucan chains during cell deformation: implications of the mechanical performance of Arabidopsis hypocotyls with pectin alterations. Molecular Plant . , (2009).
- Cavalier, D. M., Keegstra, K. Two xyloglucan xylosyltransferases catalyze the addition of multiple xylosyl residues to cellohexaose. Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34197-34197 (2006).
- Leonard, R. Identification of an Arabidopsis gene encoding a GH95 alpha1,2-fucosidase active on xyloglucan oligo- and polysaccharides. Phytochemistry. 69 (10), 1983-1983 (2008).
- Cavalier, D. M., Keegstra, K. Two xyloglucan xylosyltransferases catalyze the addition of multiple xylosyl residues to cellohexaose. Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34197-34197 (2006).
- Lee, C. H. The irregular xylem9 mutant is deficient in xylan xylosyltransferase activity. Plant and Cell Physiology. 48 (11), 1624-1624 (2007).
- Iglesias, N. Apoplastic glycosidases active against xyloglucan oligosaccharides of Arabidopsis thaliana. Plant and Cell Physiology. 47 (1), 55-55 (2006).
- Fujino, T., Sone, Y., Mitsuishi, Y., Itoh, T. Characterization of cross-links between cellulose microfibrils, and their occurrence during elongation growth in pea epicotyl. Plant Cell Physiol. 41 (4), 486-486 (2000).
- Vanzin, G. F. The mur2 mutant of Arabidopsis thaliana lacks fucosylated xyloglucan because of a lesion in fucosyltransferase AtFUT1. PNAS. 99 (5), 3340-3340 (2002).
- Cavalier, D. M. Disrupting two Arabidopsis thaliana xylosyltransferase genes results in plants deficient in xyloglucan, a major primary cell wall component. Plant Cell. 20 (6), 1519-1519 (2008).
- Hilz, H. A comparison of liquid chromatography, capillary electrophoresis, and mass spectrometry methods to determine xyloglucan structures in black currants. Journal of Chromatography A. 1133 (1-2), 275-275 (2006).
- Pauly, M. Effects of the mur1 mutation on xyloglucans produced by suspension-cultured Arabidopsis thaliana cells. Planta. 214 (1), 67-67 (2001).
