Summary
Ett snabbt sätt beskrivs att få insikt i strukturen för polysackariderna i ett extracellulärt matrix. Metoden drar nytta av särdragen hos glycosylhydrolases och känslighet masspektrometri tillåta små mängder av material som skall analyseras. Denna teknik kan anpassas för att användas direkt på vävnaden själv.
Abstract
Den direkta kontakten med celler för miljön förmedlas i många organismer genom ett extracellulärt matrix. En vanlig aspekt av extracellulära matriser är att de innehåller komplexa socker beståndsdelarna i form av glykoproteiner, proteoglykaner och / eller polysackarider. Exempel på den extracellulära matrix av människor och djurceller i huvudsak består av fibrillar proteiner och proteoglykaner eller polysackarid bygger murar cell av växter och svampar, samt proteoglycan / glykolipiden bygger murar cell av bakterier. Alla dessa glycostructures spelar avgörande roller i cell-till-cell och cell-till-miljö kommunikation och signalering.
En extra komplext exempel på en extracellulär matrix finns i väggarna i högre växtceller. Deras vägg består nästan helt av socker, upp till 75% torr vikt, och består av de mest förekommande biopolymerer finns på denna planet. Därför är forskningen hur man utnyttjar dessa material bäst som en koldioxidneutral förnyelsebar resurs för att ersätta petrokemiska härrör från fossila bränslen. Den största utmaningen för bränslekonvertering förblir motspänstighet i väggarna för att enzymatisk eller kemisk nedbrytning på grund av den unika glycostructures som finns i denna unika biokompositmaterial.
Här presenterar vi en metod för snabb och känslig analys av muren växtcell glycostructures. Denna metod oligo Mass profilering (OLIMP) är baserad på enzymatisk frisättning av oligosackarider från väggmaterial underlätta specifika glycosylhydrolases och efterföljande analys av solubilized oligosackarid blandningar med hjälp av matris-assisterad laser desorption / jonisering time-of-flight masspektrometri (MALDI-TOF/MS ) 1 (Figur 1). OLIMP kräver väggar endast 5000 celler för en fullständig analys kan utföras på vävnaden i sig 2, och är mottaglig för hög genomströmning analys 3. Medan det absoluta beloppet av solubilized oligosackarider inte kan fastställas genom OLIMP den relativa förekomsten av de olika oligosackarid joner kan avgränsas från massan spektra ger insikter om ersättning-mönster av den infödda polysackarid som finns i väggen.
OLIMP kan användas för att analysera ett brett utbud av muren polymerer, begränsas bara av tillgången till särskilda enzymer 4. Till exempel, för analys av polymerer som finns i väggen växters cell-enzymer finns tillgängliga för att analysera hemicellulosan xyloglucan med en xyloglucanase 5, 11, 12, 13, xylan med en endo-β-(1,4)-xylanas 6,7 eller för pektinämnen polysackarider med en kombination av en polygalakturonas och en methylesterase 8. Vidare kan enligt samma principer för OLIMP glycosylhydrolase och även glycosyltransferase aktiviteter övervakas och bestämmas 9.
Protocol
Den OLIMP Metoden exemplifieras på de stora hemicellulosa som finns i cellväggarna i dicot växter, xyloglucan, med hjälp av en endoglucanase som glycosylhydrolase. Metoden visade med hela Arabidopsis plantor som växtvävnad källa. Enzymet och extracellulär matrix material kan ersättas beroende på önskad analys med samma förfarande.
1. Cellvägg isolering
- Harvest fem 5-dagars gamla hela Arabidopsis plantor eller motsvarande belopp i din önskade materialet och överför dem till en 1,5 mL reaktionsrör. Se till att materialet placeras i botten av röret.
- Lägg till två 3mm metallkulor till reaktionsrör ovanpå provet och snap-frysa i flytande kväve.
- Finfördela frysta provet med en kulkvarnar (2:30 min, 25Hz).
- Tillsätt 1 mL 70% vattenlösning etanol till provet. Ta bort metallkulor med hjälp av en magnet. Vortex noggrant.
- Centrifugera provet vid 14.000 rpm för 10min till pellets alkohol olösliga återstoden som innehåller materialet cellväggen.
- Ta försiktigt bort supernatanten genom aspiration. Se till att inte störa pelleten.
- Tillsätt 1 mL kloroform / metanol (1:1 v / v) lösning. Vortex noga för att suspendera pelleten.
- Centrifugera provet vid 14.000 rpm i 10 min och ta försiktigt bort supernatanten genom aspiration. Se till att inte störa pelleten.
- Torka provet med en koncentrator.
2. Lösningsgörande av oligosackarider
- För lösningsgörande den särskilda polysackarid i form av dess oligosackarider resuspendera torra pelleten i 25μl en lämplig buffert. För endoglucanase 50 mM Ammonium formate, pH4.5, används. Lägg 0.2U av endoglucanase. Vortex fjädring och snurra vätska ner.
- Inkubera provet för 16h vid 37 ° C i en inkubator och skakade på 300rpm.
- Avlägsna lösningsmedlet i sammandrag (vatten) med ett anrikningsverk.
3. MALDI-TOF-analys av de släppt oligosackarider
- BioRex MSZ 501 katjonbytarharts pärlor används för att avlägsna salter och enzymer från smält provet. Villkor kulorna genom att placera en delmängd i en tom kolumn och tvätta pärlor med rikliga mängder vatten.
- Lägg 5-10 BioRex pärlor till det kokade och torkade prov. Tillsätt sedan 10μl vatten, för mindre mängder material 5μl vatten kan användas. Doppa kulorna i lösningen genom att kort att snurra på röret. Inkubera i minst 10 min i rumstemperatur.
- Spot 2μl matrix (2,5-dihydroxybenzoic syra (DHB), 10mg/ml i vatten) på en MALDI måltavla. Indunsta matris lösningsmedel i vakuum leder till homogena kristaller matris kemikalie.
- Spot 2μl av desalted provlösningen ovanpå matrisen kristaller på måltavla.
Om du vill att upptäcka ett stort antal prover bara hålla på spotting i högst 3min. Denna tidsram gör att den första prickiga provet är inte torr ännu. Vänta ytterligare 2min för att säkerställa en omsorgsfull blandning av nytt upplöst matris och prov oligosackarid molekyler i den sista prickiga provet. Torka sedan måltavla i ett vakuum.
Provet / matris mix bör kristalliseras i mindre än 1min att aktivera homogen kristallisering. - Placera måltavla i en MALDI-TOF masspektrometer. Maskinen ska vara inställd på positiva reflectron läge med en accelererande spänning på 20000V och en fördröjning på 350 nm, den valda viktområde bör 500-3000 Da (kan ändras beroende på den förväntade oligomerer). Starta bränning lasern och samla 100-200 spektra per prov, som sammanställs för att skapa ett representativt spektrum (Figur 2A). Joner företräder särskilda oligosackarider kan identifieras genom sin massa under laddning (m / z) förhållande. Den jon intensiteter (topphöjd) av alla joner av intresse bör läggas upp till 100% vilket resulterar i den relativa förekomsten av varje oligosackarid i provet (Figur 2B).
4. In situ OLIMP analys
OLIMP kan också användas direkt på vävnaden utelämna någon vägg förberedelse steg. Som ett exempel etiolated hypocotyls av Arabidopsis som en växtvävnad källa används. Återigen är en endoglucanase används för att bestämma struktur hemicellulosor xyloglucan. Enzymet och vävnader som kan ersättas beroende på önskad analys med samma förfarande.
- Harvest en etiolated plantan och placera den på en tom MALDI måltavla och låt plantan torka.
- Lägg 0.5μl endoglucanase (0.4U/μl, löst i 50 mM Ammonium formate, pH4.5) på den torkade plantan på önskad plats. Se till att enzymet släppa berör delvis måltavla.
- Placera MALDI måltavla i en sluten behållare med mättar fukt för att undvika att enzymet droppe torkar ut. Inkubera plattan i kammaren för ett6h vid 37 ° C.
- Torka MALDI måltavla med växtvävnad och enzymet droppe under vakuum.
- Lägg 0.5μl matris (DHB, 10 mg / l) på toppen av varje torkad enzym plats. Låt stå 2min.
- Torka MALDI måltavla under vakuum.
- Analysera prover med MALDI-TOF. Placera måltavla med vävnaden och enzymet / matris plats (er) i en MALDI-TOF masspektrometer. Maskinen ska vara inställd på positiva reflectron läge med en accelererande spänning på 20000V och en fördröjning på 350 nm, den valda viktområde bör 500-3000 Da (kan ändras beroende på den förväntade oligomerer).
- Starta bränning lasern på matris / prov kristaller NÄSTA för att vävnaden. Se till att du inte träffar vävnaden själv, som i ett sådant fall den tid för flygning av molekylerna kommer att bli av. Samlar in omkring 20-50 spektra per plats, som sammanställs för att skapa ett representativt spektrum (Figur 3). Joner företräder särskilda oligosackarider kan identifieras genom sin massa under laddning (m / z) förhållande. Den jon intensiteter (jon höjd) kan rapporteras och alla joner av intresse bör läggas upp till 100% vilket resulterar i den relativa förekomsten av varje oligosackarider i provet.
5. Representativa resultat
Ett exempel på en OLIMP analys av hemicellulosa xyloglucan närvarande i Arabidopsis plantor visas i Figur 2. På grund av massa skillnader i joner och de kända väl karakteriserade enzym (endoglucanase) specificitet jonerna kan tilldelas specifika oligosackarid strukturer (Figur 2A). Självklart kan strukturella isomerer inte urskiljas. Utgångspunkten för bestämning av den relativa förekomsten av de olika oligosackarider (figur 2B) är att deras massa spec responsfaktorn är mycket likartad för de oligosackarider. Som du ser här är OLIMP kvantifiering mycket reproducerbar. Observera dock att att metoden är starkt beroende av signal-brus-förhållandet mellan de olika oligosackarid joner. Till exempel förorening med salter eller lägre mängder oligosackarider kan minska denna kvot.
Den OLIMP analys av vävnaden i sig (in situ analys) möjliggör studier av mycket små och definierade områden och innebär mycket lite provberedning. I exemplet som presenteras här (Figur 3) inga kvalitativa (samma joner) men kvantitativa skillnader (variation i jon intensiteter) observerades mellan skjuta och root-vävnad i Arabidopsis plantor. Permutationer av OLIMP-metoden kan därmed leda till vävnad "imaging".
Figur 1. Flödesschema för OLIMP proceduren med hela Arabidopsis plantor som växt källa. För det första är vävnaden urlakade och cellvägg material är beredd (Bilden modifierad från Fujino et al. 10). Då oligosackarider av en viss vägg polysackarid frigörs med hjälp av en specifik hydrolas. Slutligen är den relativa förekomsten av de lösliga oligosackarider bestäms med MALDI-TOF masspektrometri.
Figur 2. Relativt gott om xyloglucan oligosackarider i etiolated plantor från Arabidopsis som bestäms av OLIMP. A) representant xyloglucan oligosackarid masspektrum, varje jon representerar en specifik oligosackarid struktur, kan strukturella isomerer inte urskiljas. B) Motsvarande stapeldiagram för bestämning av den relativa oligosackarid överflöd.
Figur 3. In situ OLIMP analys med etiolated plantor av Arabidopsis som exempel. Varje enzym / matsmältningen droppe (färgade cirklar) kan analyseras självständigt och en motsvarande masspektra kan erhållas och analyseras.
Figur 4. OLIMP spektrum av hemicellulosa xylan erhålls genom uppslutning Miscanthus blad material med en xylanas (Megazyme).
Discussion
Den OLIMP metoden som presenteras här ger en mycket känslig och snabb analys av polymerer som finns i det extracellulära matriser. OLIMP kombinerar enzymatiska versionen av oligomerer med påföljande MALDI-TOF-analys. Generering av en MALDI-TOF-spektrum tar mindre än en minut, därav OLIMP är lämplig för ett brett spektrum av tillämpningar, inklusive hög genomströmning studier som mutant skärmar. OLIMP är inte begränsad till fabriken polysackarider, men kan eventuellt användas för ett brett spektrum av polymerer, endast begränsas av tillgången till särskilda hydrolytiska enzymer. Det är dock en begränsning av OLIMP att en absolut överflöd av polymeren inte kan erhållas.
Som tidigare nämnts OLIMP kan användas för att studera strukturen av en mängd olika polysackarider som finns i den extracellulära matrisen av en mångfald av arter. Som ett exempel, utgör Figur 4 en OLIMP spektrum av de stora hemicellulosa i gräsarter, xylan. Här var cellväggen material som härrör från de tempererade gräs Miscanthus upplösas med en xylanas.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats av Energimyndigheten biovetenskaper institutets bidrag OO0G01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,5-dihydroxybenzoic acid | Sigma-Aldrich | 37550 | 10mg/mL in water |
| BioRex MSZ 501(D) Resin | Bio-Rad | 142-7425 | |
| Endoglucanase | Megazyme | E-CELTR | |
| Xylanase M6 | Megazyme | E-XYRU6 | |
| 3mm metal balls | Retsch | 22.455.0011 | |
| Beat mill | Retsch | Mixer Mill MM400 | |
| MALDI-TOF | Shimadzu Corporation | Axima Performance | |
| MALDI target plate | Kratos Analytical | DE4555TA | |
| SpeedVac | Eppendorf | Vacufuge 5301 | |
| Vacuum manifold | EMD Millipore | MSVMHTS00 | |
| Vacuum pump | Welch Allyn | DryFast Ultra 2032 |
References
- Lerouxel, O. Rapid structural phenotyping of plant cell wall mutants by enzymatic oligosaccharide fingerprinting. Plant Physiology. 130 (4), 1754-1754 (2002).
- Obel, N. Microanalysis of plant cell wall polysaccharides. Molecular Plant. 2 (5), 922-922 (2009).
- Mouille, G. Quantitative trait loci analysis of primary cell wall composition in Arabidopsis. Plant Physiology. 141 (3), 1035-1035 (2006).
- Bauer, S. Development and application of a suite of polysaccharide-degrading enzymes for analyzing plant cell walls. PNAS. 103 (30), 11417-11417 (2006).
- Pauly, M. A xyloglucan-specific endo-beta-1,4-glucanase from Aspergillus aculeatus: expression cloning in yeast, purification and characterization of the recombinant enzyme. Glycobiology. 9 (1), 93-93 (1999).
- Aboughe-Angone, S. Cell wall carbohydrates from fruit pulp of Argania spinosa: structural analysis of pectin and xyloglucan polysaccharides. Carbohydr Res. 343 (1), 67-67 (2008).
- Brown, D. M. Comparison of five xylan synthesis mutants reveals new insight into the mechanisms of xylan synthesis. Plant Journal. 52 (6), 1154-1154 (2007).
- Lee, C. The PARVUS gene is expressed in cells undergoing secondary wall thickening and is essential for glucuronoxylan biosynthesis. Plant Cell Physiol. 48 (12), 1659-1659 (2007).
- Obel, N. Pectin may hinder the unfolding of xyloglucan chains during cell deformation: implications of the mechanical performance of Arabidopsis hypocotyls with pectin alterations. Molecular Plant . , (2009).
- Cavalier, D. M., Keegstra, K. Two xyloglucan xylosyltransferases catalyze the addition of multiple xylosyl residues to cellohexaose. Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34197-34197 (2006).
- Leonard, R. Identification of an Arabidopsis gene encoding a GH95 alpha1,2-fucosidase active on xyloglucan oligo- and polysaccharides. Phytochemistry. 69 (10), 1983-1983 (2008).
- Cavalier, D. M., Keegstra, K. Two xyloglucan xylosyltransferases catalyze the addition of multiple xylosyl residues to cellohexaose. Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34197-34197 (2006).
- Lee, C. H. The irregular xylem9 mutant is deficient in xylan xylosyltransferase activity. Plant and Cell Physiology. 48 (11), 1624-1624 (2007).
- Iglesias, N. Apoplastic glycosidases active against xyloglucan oligosaccharides of Arabidopsis thaliana. Plant and Cell Physiology. 47 (1), 55-55 (2006).
- Fujino, T., Sone, Y., Mitsuishi, Y., Itoh, T. Characterization of cross-links between cellulose microfibrils, and their occurrence during elongation growth in pea epicotyl. Plant Cell Physiol. 41 (4), 486-486 (2000).
- Vanzin, G. F. The mur2 mutant of Arabidopsis thaliana lacks fucosylated xyloglucan because of a lesion in fucosyltransferase AtFUT1. PNAS. 99 (5), 3340-3340 (2002).
- Cavalier, D. M. Disrupting two Arabidopsis thaliana xylosyltransferase genes results in plants deficient in xyloglucan, a major primary cell wall component. Plant Cell. 20 (6), 1519-1519 (2008).
- Hilz, H. A comparison of liquid chromatography, capillary electrophoresis, and mass spectrometry methods to determine xyloglucan structures in black currants. Journal of Chromatography A. 1133 (1-2), 275-275 (2006).
- Pauly, M. Effects of the mur1 mutation on xyloglucans produced by suspension-cultured Arabidopsis thaliana cells. Planta. 214 (1), 67-67 (2001).
