מדידת פעילות Calpain בתוך תאים חיים קבוע על ידי זרימת cytometry

Summary

מאמר זה יפרט את הפרוטוקול למדידת פעילות calpain בתאים קבועים חי באמצעות cytometry הזרימה.

Abstract

Calpains נמצאים בכל מקום תאיים, סידן רגיש, פרוטאזות ציסטאין נייטרלי

Protocol

הכן ריאגנטים

הערה: כל PBS מכיל Ca ^{2 +} ו - Mg ^{2 +}

1. איתור מגיב
   הוסף 20μM 7-amino-4-chloromethyl coumarin, t-BOC, לאוצין, מתיונין אמיד (BOC-LM-CMAC) לטמפרטורת החדר PBS. כל השעיה תא ידרוש מגיב איתור 2ml.
2. Paraformaldehyde 1% (תאים קבוע)
   מדולל של 4% מניות paraformaldehyde פתרון בטמפרטורת החדר PBS. Aliquot paraformaldehyde 1mL 1% ל צינור אחד FACS. שלושה צינורות FACS נדרשים עבור כל תנאי הניסוי (דוגמה 32Dkit, 32Dkit + PD150606, 32Dkit + PD98059 צורך 9 צינורות FACS)
3. PD150606 (מעכב calpain)
   מחדש PD150606 ב DMSO לריכוז סופי של 100 מ"מ. הגן הזה מגיב וכל תאים שטופלו בו מן האור למשך הניסוי הזה.
4. PD98059 (MEK1 מעכב)
   מחדש PD98059 ב DMSO לריכוז סופי של 50mm.

הכן תאים

1. לגדל תאים 32Dkit ב 5 x ^{אוקטובר} 05-01 x 10 ⁶ תאים לכל מ"ל Opti-ממ התקשורת בתוספת 5% בסרום שור עוברית, WEHI-3 supernatant כמקור של IL-3 (או כל מקור אחר של IL-3 כאלה כמו חלבון רקומביננטי), 0.1% 2-mercaptoethanol ואנטיביוטיקה.
2. איסוף 12 x 10 ⁶ תאים 32Dkit לשלושה צינורות פלקון 15 מ"ל (4 x 10 ⁶ תאים לכל צינור).
3. גלולה התאים ב 1000 סל"ד למשך 5 דקות בשעה 15 ° C.
4. לשאוב supernatant. Resuspend התאים 2ml בטמפרטורת החדר PBS.
5. התייחס one ההשעיה תא עם 50μM PD150606. ודא המדגם מוגן מפני אור על ידי כיסוי הצינור פלקון עם רדיד אלומיניום. וורטקס דגירה קצר לאחר מכן עבור 20-30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
6. פנקו את ההשעיה התא השני עם 20μM PD98059. פלייט התאים צלחת תרבות 35mm רקמות דגירה עבור 2 שעות 37 ° C.

Calpain Assay בתוך תאים קבוע

1. בעוד דגימות הם דוגרים עם PD150606, להתחיל את assay calpain על דגימות מטופל. בגין על ידי הוספת מגיב איתור 2ml להשעיית כל תא. מיד להוסיף 1mL של ההשעיה תא / מגיב תערובת זיהוי צינורות FACS הכין בעבר עם paraformaldehyde 1% (0 דקות נקודת זמן).
2. דגירה השעיות תא מגיב עם זיהוי במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. ואז להוסיף 1mL ההשעיה לתא צינור FACS עם paraformaldehyde 1mL 1%.
3. המשך דוגרים השעיות תא בתערובת גילוי 5 דקות נוספות בטמפרטורת החדר. ואז להוסיף 1mL ההשעיה לתא צינור FACS עם paraformaldehyde 1mL 1%.
4. חזור assay calpain על תאים 32Dkit כי טופלו במעכבי.
5. תקן תאים לילה בחושך ב 4 ° C.
6. יום גלולה הבא התאים ב 1800 סל"ד למשך 5 דקות בשעה 15 ° C.
7. לשאוב supernatant. Resuspend התאים 750uL PBS. המקום התאים על קרח ולשמור בחושך.

רוכשת את הנתונים עבור תאים קבוע

1. נתח את התאים באמצעות II LSR (BD Bioscience). מסננים מוגדרים עבור Xcyte Lightwave (UV) לייזר, קו עירור 355nm לייזר 25mW כוח, פליטה של ​​405 ו - 450 ננומטר במשך המצע ואת המוצר בהתאמה. לעבור בנד מסננים עבור המצע ואת המוצר הם 405/20 ו - 450/50. מסננים לעבור לונג על המצע ואת המוצר הם 405 ו 450. מתח PMT נקבע על 350-375 ו 325-350 על מצע עבור המוצר.
2. הגדרת ניסוי BD FACSDiva עם הפרמטרים הבאים: פיזור קדימה, פיזור צד; ההודו-1 כחול (יומן); ההודו-1 ויולט (יומן). בגליון העבודה להגדיר את הגרפים הבאים: פיזור קדימה לעומת פיזור נקודה בצד המגרש עם שער על תאים חיים (איור 1 א), הודו-1 היסטוגרמה כחול, הודו-1 היסטוגרמה ויולט, הודו-1 כחול מול הודו-1 ויולט העלילה נקודה.
3. כייל את השנייה עם LSR AlignFlow ו AlignFlow בתוספת חרוזי ניאון (Invitrogen). מתח PMT צריך להיות מותאם למקום השיא של ההיסטוגרמה הקרינה חרוז באותו ערוץ לפני כל ניסוי.
4. בגין רכישת נתונים באמצעות תאים 32Dkit בנקודת זמן 0 דקות. התאם את מתח הפרמטר לפי הצורך. רוכשת ולהקליט 10,000 אירועים לדגימה.
5. חזור על הרכישה עבור כל דגימה, שטיפה במכונה עם FACS חיץ בין צינור אחד.
6. ייצוא הנתונים. ודא LSR II הוא ניקה על פי הנחיות המכון.

Calpain Assay בתאים חיים

1. הכן את המתלים תא כאמור לעיל, ללא PD150606. תביאו את דגימות את השנייה LSR ולהקים מסננים הפרמטרים לעיל. הגדר את גליון לעיל. כלול מזימה נקודה גדולה מראה ההודו-1 כחול נגד הזמן. הגדר את תוכנית לרכוש את num מקסימליתבער של אירועים (אין שער להפסיק).
2. הוסף 50μM PD150606 אחד ההשעיה התא של תאים 32Dkit. שמור על מדגם בחושך דגירה בטמפרטורת החדר למשך 20-30 דקות.
3. בגין רכישת מידע על ההשעיה תא 32Dkit ללא PD150606. השתמש ספיקה נמוכה של 200-300 אירועים בשנייה. לאחר 30 שניות עד דקה 1 להסיר את הצינור מהמכונה. הוסף 20μM BOC-LM-CMAC אל התאים. וורטקס בקצרה ולאחר מכן להמשיך לרכוש את הנתונים.
4. רוכשת את הנתונים עבור 10-20 דקות או עד מישורים את הפעילות calpain.
5. חזור על שלבים 3 ו - 4 עם תאים 32Dkit שטופלו PD150606.
6. ייצוא הנתונים. ודא LSR II הוא ניקה על פי הנחיות המכון.

Calpain Assay ב (מעורב) אוכלוסיות מורכבות Cell

* ניסוי זה יהיה לזהות תאים 32Dkit ההשעיה תא שנקטפו מן הטחול עכבר.

1. קציר את הטחול מהעכבר כל אחד. Lyse תא דם אדום עם NH ₄ Cl במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
2. הכן השעיות תא יחיד 2ml PBS.
3. מחלקים כל השעיה התא לשניים. פנקו 1 ההשעיה תא עם 50μM PD150606 עבור 20-30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
4. המשך לעיל עבור Assay Calpain בתוך תאים קבוע (שלבים 1-6)
5. לשאוב supernatant. לשטוף את התאים 500μL PBS. לשאוב supernatant.
6. Resuspend התאים חיץ מכתים 200μL עם BSA 2%. דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
7. הכן את הנוגדן הראשוני (FITC אנטי עכבר CD117). הנוגדן אמור לשמש בדילול 1:200 ב מכתים חיץ. ודא את הנוגדן נשמרת בחושך.
8. הוסף נוגדן ראשוני 200μL אל התאים. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
9. הוסף 400μL PBS להגדיל את היקף עבור cytometry הזרימה. מניחים את התאים על הקרח ולשמור בחושך.
10. המשך כמתואר רוכשת את הנתונים עבור תאים קבוע. הוסף FITC את הפרמטרים כוללים היסטוגרמה עבור FITC בגליון העבודה.

ניתוח תוצאות נציג

1. ניתוח נתונים באמצעות FlowJo (Treestar). שער על תאים חיים המבוסס על פרופיל פיזור קדימה בצד (איור 1 א). קבע את הקרינה מתכוון הודו כחול מהשער תא קיימא (איור 1b).
2. א) אוכלוסיית תאים משולבים
   • השימוש FITC הקרינה על מגרשים histograms ו נקודה כדי לזהות את האוכלוסייה 32Dkit
   • קבע את הקרינה מתכוון הודו כחול של האוכלוסייה 32Dkit
3. השתמש ב-Microsoft Excel כדי הגרף הקרינה אומר (איור 2 א). חשב את השיפוע של הקו בין 5 ל 10 דקות. שיפוע גרף בצורת תרשים עמודות כדי לקבוע פעילות calpain בתאים (איור 2b).

איור 1a. קביעת תאים חיים המבוסס על פרופיל פיזור קדימה בצד.

איור 1b. שינוי ממוצע הקרינה לאורך זמן 10 דקות.

איור 2 א. נציג גרף של הקרינה מתכוון.

איור 2b. Calpain פעילות בתאים 32Dkit עם מעכבי.

Discussion

הפעילות calpain בתאים 32Dkit קבוע וחיים נקבע בפרוטוקול הווידאו הזאת. טיפול קו התא עם מעכב calpain PD150606 הביא עיכוב מלא של פעילות calpain בתאים. בנוסף, טיפול מעכב MEK1 PD98059 הביא עיכוב מלא של פעילות calpain בתאים. ERK הוא activator העיקריים של calpain-2 ^3. התוצאות מראות כי calpain-2 הפעילות העיקרי בתאי 32Dkit. עבודה נוכחי במעבדה שלנו היא חוקרת את ההשלכות של פעילות מוגברת calpain את תרומתם של calpain-1 ו-2 calpain ב לוקמיה.

פרטים זה פרוטוקול הזרם הראשון cytometric assay המבוסס כדי למדוד את רמות הפעילות calpain בתאים קבועים חי והוא יכול לשמש כדי להבין את מנגנון ויסות calpain ותפקידה תהליכים פתולוגיים באמצעות תאים שלמים.

פרוטוקול זה יכול להיות שונה כדי לבדוק את ההשפעות של מעכבי או מניפולציות הגן על פעילות calpain. בנוסף, assay זה יכול להיות מנוצל כדי למדוד את פעילות calpain בתערובת מורכבת של תאים כגון דם טבורי או לזהות ולמדוד פעילות calpain ב תת תא מבודד מן הטחול.

Assay זה אינו מבחין בין פעילות שנוצר על ידי isoforms שונים של calpain. ריאגנטים גנטיים או תרופתיים כי להפיל או לעכב calpains מסוים יכול לשמש כדי לטפל בבעיה זו.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS BOC-LM-CMAC 4% paraformaldehyde	Invitrogen		Dissolve 4g paraformaldehyde in 100mL PBS. In fume hood, heat sample with stirring until clear. Let cool then store at 4°C
PD150606	Invitrogen		Use freshly reconstituted PD150606 for maximal calpain inhibition.
PD98059	Cell Signaling Technology
AlignFlow, AlignFlow plus fluorescent beads FACS tubes	Invitrogen
LSR II	BD Biosciences		Supernatant of WEHI-3 cells is used as a source of IL-3 in these experiments. Each collection of WEHI-3 supernatant is titrated to determine the optimal concentration used for 32Dkit cell growth.