Summary
この記事では、フローサイトメトリーを用いて固定し、生きた細胞内のカルパイン活性を測定するための詳細プロトコルを務める。
Abstract
カルパインは、ユビキタス細胞、カルシウム感受性、中立的なシステインプロテアーゼです。
Protocol
試薬を準備する
注：すべてのPBSは、Ca 2 +およびMg 2を含む+
- 検出試薬
室温のPBSに20μM7 - アミノ-4 - クロロメチルクマリン、T - BOC -ロイシン - メチオニンアミド（BOC - LM - CMAC）を追加します。各細胞懸濁液は、2mLの検出試薬が必要になります。 - 1％パラホルムアルデヒド（固定セル）
室温のPBS中4％パラホルムアルデヒドのストック溶液を希釈する。各FACSチューブへ分注し1mLの1％パラホルムアルデヒド。三FACSチューブは、各実験条件（例：32Dkit、32Dkit + PD150606、32Dkit + PD98059必要性9 FACSチューブ）のために必要です。 - PD150606（カルパイン阻害剤）
100mmの最終濃度にDMSOで再構成PD150606。この試薬と、この実験の期間中、軽いからそれで処理するすべてのセルを保護する。 - PD98059（MEK1阻害剤）
50mmの最終濃度にDMSOで再構成PD98059。
セルを準備する
- IL - 3（またはIL - 3などのための他のソースのソースとして5％ウシ胎児血清、WEHI - 3上清を添加したのOpti - MEM培地中でmL当たり5 × 10 5〜1 × 10 6細胞で32Dkit細胞を成長させる組換えタンパク質として）、0.1％2 - メルカプトエタノール及び抗生物質。
- three 15mlのファルコンチューブ（試験管当たり4 × 10 6細胞）に12 × 10 6 32Dkit細胞を集めます。
- 15℃5分間1000rpmでペレットは、細胞を℃に
- 上清を吸引除去する。 2mLの室温のPBSで細胞を再懸濁します。
- 50μMPD150606で一つの細胞懸濁液を扱います。サンプルをアルミ箔でファルコンチューブを被覆して光から保護されていることを確認します。ボルテックスは簡潔にして暗所で室温で20分から30分インキュベートする。
- 20μMPD98059と第二の細胞懸濁液を扱います。板37で2時間35ミリメートル組織培養皿とインキュベートにおける細胞℃に
固定化細胞におけるカルパインのアッセイ
- サンプルはPD150606と共にインキュベートされているが、未処理の試料でカルパインアッセイを開始します。各細胞懸濁液に2mLの検出試薬を追加することから始めます。直ちに1％パラホルムアルデヒド（0分の時点）で事前に準備されたFACSチューブに細胞懸濁液/検出試薬の混合液1mLを加える。
- 室温で5分間検出試薬で細胞懸濁液をインキュベートする。次に1mLの1％パラホルムアルデヒドでFACSチューブに細胞懸濁液1mLを加える。
- 室温でさらに5分間検出混合物を用いて細胞懸濁液をインキュベート続ける。次に1mLの1％パラホルムアルデヒドでFACSチューブに細胞懸濁液1mLを加える。
- 阻害剤で治療されている32Dkit細胞のカルパインのアッセイを繰り返します。
- 4℃で暗所で一晩細胞を固定℃に
- 翌日ペレット15℃、5分間1800rpmで細胞を℃に
- 上清を吸引除去する。 750uL PBSで細胞を再懸濁します。氷の上に細胞を配置し、暗所で保管。
固定セルのデータを取得する
- LSR II（BDバイオサイエンス）を用いて細胞を分析する。フィルタは、光Xcyte（UV）レーザー、励起線波長355nm、レーザーパワー25mWを、それぞれ基板と製品の405と450nmの発光のために設定されています。基質と生成物のためのバンドパスフィルタは、20分の405と50分の450です。基質と生成物のためのロングパスフィルターは、405と450です。 PMT電圧は、製品の基板のための350から375と325から350に設定されました。
- 、側方散乱光、インド - 1ブルー（ログ）、インド- 1バイオレット（ログ）前方散乱：次のパラメータを持つBD FACSDiva実験アップを設定します。前方散乱対生きた細胞でのゲート（図1a）、インド- 1ブルーヒストグラム、インド- 1バイオレットのヒストグラム、インド - 1ブルー対インド- 1バイオレットと側方散乱ドットプロット：ワークシートに以下のグラフを設定するドットプロット。
- AlignFlowとAlignFlowプラス蛍光ビーズ（Invitrogen）でLSR IIを校正します。 PMT電圧は前の実験ごとに同じチャンネルでビーズ蛍光ヒストグラムのピークを配置するために調整する必要があります。
- 0分の時点で32Dkitセルを使用してデータの取得を開始。必要に応じて、パラメータの電圧を調整します。サンプル10,000個のイベントを取得し、記録する。
- 各チューブの間にFACSバッファーでマシンをすすぎ、各サンプルのために買収を繰り返します。
- データをエクスポートします。 LSR IIは、研究所のガイドラインにしたがって洗浄されていることを確認します。
生細胞におけるカルパインのアッセイ
- ないPD150606と、上記のように細胞懸濁液を準備する。 LSR IIにサンプルを持参し、上記のようにフィルタとパラメータを設定します。上記のようにワークシートを設定します。インド- 1ブルー対時間を示す大規模なドットプロットが含まれています。最大numを取得するプログラムを設定するイベントのBER（無停止のゲート）。
- 32Dkit細胞の50μMPD150606 1つの細胞懸濁液を追加します。暗闇の中でサンプルを保ち、20〜30分室温でインキュベートする。
- ないPD150606と32Dkit細胞懸濁液上にデータの取得を開始。毎秒200から300までのイベントの低流量を使用してください。 30秒から1分後にマシンからチューブを取り外します。細胞に20μMBOC - LM - CMACを追加。ボルテックスは簡潔にしてデータを取得し続けます。
- 10-20分間、またはカルパイン活性がプラトーになるまでデータを取得する。
- PD150606で処理32Dkit細胞と、手順3と4を繰り返します。
- データをエクスポートします。 LSR IIは、研究所のガイドラインにしたがって洗浄されていることを確認します。
コンプレックス（混合）細胞集団におけるカルパインのアッセイ
*この実験は、マウスの脾臓から採取した細胞懸濁液に32Dkit細胞を識別します。
- 各マウスから脾臓を回収する。室温で10分間、NH 4 Clで赤血球を溶解する。
- 2mLのPBSで単一の細胞懸濁液を準備します。
- 二つに各細胞懸濁液を分ける。暗所で室温で20〜30分間、50μMPD150606 1細胞懸濁液を扱います。
- 固定化細胞におけるカルパインアッセイ（ステップ1-6）のために上記のように進んでください
- 上清を吸引除去する。 500μLのPBSで細胞を洗浄。上清を吸引除去する。
- 2％BSAを200μL染色バッファーで細胞を再懸濁します。室温で15分間インキュベートする。
- 一次抗体（FITC抗マウスCD117）を準備する。抗体は、バッファを染色で1:200希釈で使用してください。抗体は暗所で保管されていることを確認します。
- 細胞に200μL一次抗体を追加。暗所で室温で30分間インキュベートする。
- フローサイトメトリー用のボリュームを増加させる400μLPBSを追加。氷の上に細胞を配置し、暗所で保管。
- 固定セルのデータを取得で説明されている手順に進みます。パラメータにFITC追加し、ワークシート上にFITCのヒストグラムが含まれています。
分析と代表の結果
- FlowJo（Treestar）を使用してデータを分析する。前方および側方散乱プロファイル（図1a）に基づいて、生細胞でのゲート。生細胞のゲート（図1b）からインドブルーの平均蛍光を決定します。
- 混合細胞集団の場合）
- 32Dkit人口を識別するために、ヒストグラム、ドットプロットにFITCの蛍光を使用してください
- 32Dkitの人口のインド - ブルーの平均蛍光を決定する
- 平均蛍光（図2a）は、グラフにMicrosoft Excelを使用してください。 5〜10分の間の直線の傾きを計算する。グラフの傾き（図2b）細胞におけるカルパインの活性を決定するために棒グラフとして。
図1a。前方および側方散乱プロファイルに基づいて生細胞を決定する。
図1bは、10分の時間経過とともに蛍光変化を平均。
図2a。平均蛍光の代表グラフ。
インヒビターを有する32Dkit細胞における図2b。カルパイン活性。
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Discussion
固定と生活32Dkit細胞におけるカルパイン活性はこのビデオのプロトコルで決定されている。カルパイン阻害剤PD150606を有する細胞系の治療は、細胞内のカルパイン活性の完全な阻害をもたらした。さらに、MEK1阻害剤PD98059による治療は、細胞内のカルパイン活性の完全な阻害をもたらした。 ERKは、カルパイン- 2 3の主要な活性剤です。これらの結果は、カルパイン- 2活性が32Dkit細胞で優勢であることを示唆している。我々の研究室の現在の仕事は、増加したカルパイン活性の結果と白血病におけるカルパイン- 1とカルパイン- 2の貢献を検討しています。
このプロトコルの詳細は固定と生きた細胞におけるカルパイン活性レベルを測定するために最初のフローサイトメトリーベースのアッセイとは、カルパイン規制と無傷の細胞を用いて病理学的プロセスにおけるその役割のメカニズムを理解するために使用することができます。
このプロトコルは、カルパインの活性に対する阻害剤や遺伝子操作の影響を検討するように変更することができます。さらに、このアッセイは、臍帯血または脾臓から分離した細胞サブセットにおけるカルパインの活動を識別し、測定するなど、細胞の複雑な混合物中のカルパイン活性を測定するために利用することができます。
このアッセイは、カルパインの異なるアイソフォームによって生成されたアクティビティを区別しません。ノックダウンまたは特定のカルパインを阻害する遺伝的または薬理学的試薬は、この問題に対処するために使用することができます。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
保健研究、カナダの白血病とリンパ腫協会とカナダのリンパ腫財団のカナダの協会からの補助金によって支え。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS BOC-LM-CMAC 4% paraformaldehyde | Invitrogen | Dissolve 4g paraformaldehyde in 100mL PBS. In fume hood, heat sample with stirring until clear. Let cool then store at 4°C |
|
| PD150606 | Invitrogen | Use freshly reconstituted PD150606 for maximal calpain inhibition. | |
| PD98059 | Cell Signaling Technology | ||
| AlignFlow, AlignFlow plus fluorescent beads FACS tubes | Invitrogen | ||
| LSR II | BD Biosciences | Supernatant of WEHI-3 cells is used as a source of IL-3 in these experiments. Each collection of WEHI-3 supernatant is titrated to determine the optimal concentration used for 32Dkit cell growth. |
References
- Goll, D. E., Thompson, V. F., Li, H., Wei, W., Cong, J. The Calpain System. Physiol. Rev. 83, 731-801 (2003).
- Niapour, M., Berger, S. A. Flow Cytometric Measurement of Calpain Activity in Living Cells. Cytometry A. 71A, 475-485 (2007).
- Leloup, L., Daury, L., Mazéres, G., Cottin, P. Involvement of the ERK/MAP kinase signalling pathway in milli-calpain activation and myogenic cell migration. The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 39, 1177-1189 (2007).
