Het meten van calpaïne Activiteit in vaste en levende cellen door flowcytometrie

Summary

Dit artikel zal detail het protocol voor het meten van calpaïne activiteit in de vaste en levende cellen met behulp van flow cytometrie.

Abstract

Calpains zijn alomtegenwoordig intracellulaire, calcium-gevoelige, neutrale cysteine ​​proteases

Protocol

Reagentia voor te bereiden

Opmerking: Alle PBS bevat Ca ^{2 +} en Mg ^{2 +}

1. Detectie Reagens
   Voeg 20μM 7-amino-4-chloormethyl coumarine, t-BOC-Leucine-methionine amide (BOC-LM-CMAC) op kamertemperatuur PBS. Elke cel schorsing vereist 2 ml detectie reagens.
2. 1% Paraformaldehyde (vaste cellen)
   Verdunnen 4% paraformaldehyde stockoplossing bij kamertemperatuur PBS. Aliquot 1 ml 1% paraformaldehyde aan elke FACS buis. Drie FACS buizen zijn nodig voor elke experimentele conditie (ex. 32Dkit, 32Dkit + PD150606, 32Dkit + PD98059 nodig 9 FACS buizen)
3. PD150606 (calpaïne-remmer)
   Reconstrueren PD150606 in DMSO bij een uiteindelijke concentratie van 100 mm. Bescherm dit reagens en alle cellen behandeld met het tegen licht voor de duur van dit experiment.
4. PD98059 (MEK1-remmer)
   Reconstrueren PD98059 in DMSO bij een uiteindelijke concentratie van 50 mm.

Cellen voor te bereiden

1. Grow 32Dkit cellen op 5 x 10 ⁵ tot 1 x 10 ⁶ cellen per ml bij Opti-MEM media aangevuld met 5% foetaal runderserum, WEHI-3 supernatant als een bron van IL-3 (of een andere bron voor IL-3 van dergelijke als recombinant eiwit), 0,1% 2-mercapto-ethanol en antibiotica.
2. Verzamel 12 x 10 ⁶ 32Dkit cellen in drie 15ml Falcon buizen (4 x 10 ⁶ cellen per buis).
3. Pellet de cellen bij 1000 rpm gedurende 5 minuten bij 15 ° C.
4. Zuig het supernatant. Resuspendeer de cellen in 2 ml PBS kamertemperatuur.
5. Behandel een celsuspensie met 50μM PD150606. Zorg ervoor dat het monster is beschermd tegen licht door het bedekken van de Falcon buis met aluminium folie. Vortex kort daarna incubeer gedurende twintig tot dertig minuten bij kamertemperatuur in het donker.
6. Behandel het tweede celsuspensie met 20μM PD98059. Het bord van de cellen in een 35-mm weefselkweek schotel en incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C.

Calpaïne Assay in vaste cellen

1. Terwijl de monsters worden incubatie met PD150606, beginnen met het calpaïne test op de onbehandelde monsters. Begin door het toevoegen van 2 ml detectie reagens voor elke celsuspensie. Onmiddellijk toevoegen 1 ml van de celsuspensie / detectie reagens mengsel aan de vooraf bereide FACS buizen met 1% paraformaldehyde (0 minuten tijd punt).
2. Incubeer celsuspensies met detectie reagens gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens 1 ml van de celsuspensie op een FACS buis met 1 ml 1% paraformaldehyde.
3. Ga door het incuberen van de celsuspensies met detectie mengsel voor nog eens 5 minuten bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens 1 ml van de celsuspensie op een FACS buis met 1 ml 1% paraformaldehyde.
4. Herhaal calpaïne test op 32Dkit cellen die zijn behandeld met remmers.
5. Fix-cellen 's nachts in het donker bij 4 ° C.
6. De volgende dag pellet de cellen bij 1800 tpm gedurende 5 minuten bij 15 ° C.
7. Zuig het supernatant. Resuspendeer de cellen in 750uL PBS. Plaats cellen op ijs en te houden in het donker.

Acquire Gegevens voor vaste cellen

1. Analyseer de cellen met behulp van een LSR II (BD Bioscience). Filters zijn ingesteld voor de Lightwave Xcyte (UV) laser, excitatie lijn 355nm en laser 25mW vermogen, emissie van 405 en 450 nm voor substraat en product respectievelijk. Band pass filters voor substraat en product zijn 405/20 en 450/50. Lange pass filters voor substraat en product zijn 405 en 450. Het PMT voltage is ingesteld op 350-375 voor de ondergrond en 325-350 voor het product.
2. Set-up een BD FACSDiva experiment met de volgende parameters: voorwaartse verstrooiing, zijwaartse verstrooiing, Indo-1 blauw (log), Indo-1 Violet (log). Op het werkblad het instellen van de volgende grafieken: voorwaartse verstrooiing versus zijwaartse verstrooiing dot plot met een hek op levende cellen (figuur 1a), Indo-1 blauw histogram, Indo-1 Violet histogram, Indo-1 blauw versus Indo-1 Violet dot plot.
3. Kalibreer het LSR II met AlignFlow en AlignFlow plus fluorescerende beads (Invitrogen). De PMT spanning moet worden aangepast aan de top van de kraal fluorescentie histogram plaats in hetzelfde kanaal voorafgaand aan elk experiment.
4. Begin het verwerven van gegevens met behulp van de 32Dkit cellen op het 0 minuten tijdstip. Stel parameter spanningen als nodig is. Verwerven en op te nemen 10.000 gebeurtenissen per monster.
5. Herhaal aanwinst voor elk monster, het spoelen van de machine met FACS buffer tussen elke buis.
6. De gegevens exporteren. Zorg ervoor dat LSR II wordt gereinigd volgens de richtlijnen instituut.

Calpaïne Assay in levende cellen

1. Bereid de celsuspensies als hierboven, met geen PD150606. Breng de monsters naar het LSR II en het opzetten van filters en parameters zoals hierboven. Stel het werkblad zoals hierboven. Omvatten een grote dot plot toont Indo-1 blauw versus tijd. Stel het programma om het maximum aantal te verwervenBER van gebeurtenissen (geen stop gate).
2. Voeg 50μM PD150606 aan een celsuspensie van 32Dkit cellen. Houd het monster in het donker en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 20-30 minuten.
3. Begin het verwerven van gegevens over de 32Dkit celsuspensie met geen PD150606. Gebruik een laag debiet van 200-300 gebeurtenissen per seconde. Na 30 seconden tot 1 minuut te verwijderen van de slang uit de machine. Voeg 20μM BOC-LM-CMAC naar de cellen. Vortex kort dan verder het verwerven van de gegevens.
4. Verkrijgen gegevens voor 10-20 minuten of tot de calpaïne activiteit plateaus.
5. Herhaal stap 3 en 4 met 32Dkit cellen behandeld met PD150606.
6. De gegevens exporteren. Zorg ervoor dat LSR II wordt gereinigd volgens de richtlijnen instituut.

Calpaïne Assay in complexe (Mixed) celpopulaties

* Dit experiment zal identificeren 32Dkit cellen in een celsuspensie geoogst uit een muis-milt.

1. Oogst de milt van elke muis. Lyse de rode bloedcel met NH ₄ Cl gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
2. Bereid enkele cel suspensies in 2 ml PBS.
3. Verdeel elke cel suspensie in twee. Behandel een celsuspensie met 50μM PD150606 gedurende 20-30 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
4. Ga te werk zoals hierboven voor de calpaïne test in vaste cellen (Stappen 1-6)
5. Zuig het supernatant. Was de cellen in 500μL PBS. Zuig het supernatant.
6. Resuspendeer de cellen in 200μL kleuring buffer met 2% BSA. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
7. Bereid de primaire antilichaam (FITC anti-muis CD117). Het antilichaam moet worden gebruikt bij een 1:200 verdunning in vlekken buffer. Zorg ervoor dat het antilichaam wordt bewaard in het donker.
8. Voeg 200μL primaire antistof naar de cellen. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
9. Voeg 400μL PBS om het volume voor flowcytometrie te verhogen. Plaats de cellen op ijs en te houden in het donker.
10. Ga te werk zoals beschreven in Acquire gegevens voor vaste cellen. Voeg FITC om de parameters en omvatten een histogram voor FITC op het werkblad.

Analyse en representatieve resultaten

1. Analyseren van gegevens met behulp van FlowJo (Treestar). Gate op levende cellen op basis van voor-en zijwaartse verstrooiing profiel (figuur 1a). Bepaal de gemiddelde fluorescentie voor de Indo-Blue van de levensvatbare cel poort (Figuur 1b).
2. a) Voor het Gemengd celpopulatie
   • gebruik van FITC fluorescentie op histogrammen en dot plots aan de 32Dkit populatie
   • Bepaal de gemiddelde fluorescentie voor de Indo-Blauw van de bevolking 32Dkit
3. Gebruik Microsoft Excel de grafiek van de gemiddelde fluorescentie (Figuur 2a). Bereken de helling van de lijn tussen de 5 en 10 minuten. Grafiek de helling als een staafdiagram te calpaïne activiteit te bepalen in de cellen (Figuur 2b).

Figuur 1a. Bepaling van levende cellen op basis van voor-en zijwaartse verstrooiing profiel.

Figuur 1b. De gemiddelde fluorescentie veranderen in de loop 10 minuten de tijd natuurlijk.

Figuur 2a. Vertegenwoordiger grafiek van de gemiddelde fluorescentie.

Figuur 2b. Calpaïne activiteit in 32Dkit cellen met remmers.

Discussion

De calpaïne activiteit in de vaste en levende cellen 32Dkit is bepaald in deze video protocol. Behandeling van de cel lijn met de calpaïne remmer PD150606 resulteerde in complete remming van calpaïne activiteit in de cellen. Daarnaast is behandeling met de remmer MEK1 PD98059 resulteerde in complete remming van calpaïne activiteit in de cellen. ERK is een belangrijke activator van calpaïne-2 ^3. Deze resultaten suggereren dat calpaïne-2 activiteit is overheersend in de 32Dkit cellen. Huidige werk in ons laboratorium onderzoekt de gevolgen van de toegenomen calpaïne activiteit en de bijdragen van calpaïne-1 en calpaïne-2 in leukemie.

Dit protocol beschrijft de eerste geldstroom cytometrische gebaseerde test voor calpaïne activiteit in de vaste en levende cellen te meten en kan gebruikt worden om het mechanisme van calpaïne regelgeving en de rol ervan in pathologische processen met behulp van intacte cellen te begrijpen.

Dit protocol kan worden aangepast om de effecten van remmers of gen-manipulaties op calpaïne activiteit te onderzoeken. Daarnaast kan deze test worden gebruikt om calpaïne activiteit te meten in een complex mengsel van cellen zoals navelstrengbloed of te identificeren en te meten calpaïne activiteit in cel subsets geïsoleerd van de milt.

Deze test maakt geen onderscheid tussen activiteiten die door verschillende isovormen van calpaïne. Genetische of farmacologische reagentia die knock-down of remmen specifieke calpains kan worden gebruikt om dit probleem op te lossen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS BOC-LM-CMAC 4% paraformaldehyde	Invitrogen		Dissolve 4g paraformaldehyde in 100mL PBS. In fume hood, heat sample with stirring until clear. Let cool then store at 4°C
PD150606	Invitrogen		Use freshly reconstituted PD150606 for maximal calpain inhibition.
PD98059	Cell Signaling Technology
AlignFlow, AlignFlow plus fluorescent beads FACS tubes	Invitrogen
LSR II	BD Biosciences		Supernatant of WEHI-3 cells is used as a source of IL-3 in these experiments. Each collection of WEHI-3 supernatant is titrated to determine the optimal concentration used for 32Dkit cell growth.