Misurazione dell'attività Calpain nelle celle fissi e Living in citometria a flusso

Summary

Questo articolo dettaglio il protocollo per la misurazione dell'attività calpaina in cellule fisse e vivere in citometria a flusso.

Abstract

Calpains sono onnipresenti intracellulari, calcio-sensibili, la cisteina proteasi neutre

Protocol

Preparare Reagenti

Nota: Tutti i PBS contiene Ca ^{2 +} e Mg ^{2 +}

1. Rilevazione dei reagenti
   Aggiungi 20μM 7-ammino-4-clorometil cumarina, t-BOC-Leucina-metionina ammide (BOC-LM-CMAC) PBS a temperatura ambiente. Ogni sospensione cellulare richiederà reagente 2 ml di rilevamento.
2. 1% paraformaldeide (Cellule fisso)
   Diluire soluzione al 4% paraformaldeide magazzino a temperatura ambiente PBS. Aliquota paraformaldeide 1 ml 1% a ciascuna provetta FACS. Tre tubi FACS sono necessari per ogni condizione sperimentale (es. 32Dkit, 32Dkit + PD150606, 32Dkit + PD98059 necessari 9 tubi FACS)
3. PD150606 (inibitore della calpaina)
   Ricostituire PD150606 in DMSO ad una concentrazione finale di 100 mm. Proteggere questo reagente e tutte le cellule trattate con il medicinale dalla luce per tutta la durata di questo esperimento.
4. PD98059 (MEK1 inibitore)
   Ricostituire PD98059 in DMSO ad una concentrazione finale di 50mM.

Preparare Cellule

1. Crescere le cellule 32Dkit a 5 x 10 ⁵ a 1 x 10 ⁶ cellule per ml di Opti-MEM dei media integrato con 5% di siero fetale bovino, WEHI-3 surnatante come fonte di IL-3 (o qualsiasi altra fonte di IL-3 come come proteina ricombinante), 0,1% 2-mercaptoetanolo e antibiotici.
2. Colleziona 12 x 10 ⁶ cellule 32Dkit in tre tubi Falcon 15 ml (4 x 10 ⁶ cellule per tubo).
3. Agglomerare le cellule a 1000 giri per 5 minuti a 15 ° C.
4. Aspirare il sopranatante. Risospendere le cellule in 2 ml di PBS a temperatura ambiente.
5. Trattare un sospensione cellulare con 50 micron PD150606. Assicurarsi che il campione è al riparo dalla luce, coprendo il tubo Falcon con un foglio di alluminio. Vortex brevemente poi incubare per 20-30 minuti a temperatura ambiente al buio.
6. Trattare la seconda sospensione cella con 20μM PD98059. Piastra le cellule in una capsula di 35 millimetri coltura e incubare per 2 ore a 37 ° C.

Saggio calpaina in cellule fissate

1. Mentre i campioni sono incubazione con PD150606, iniziare il test calpaina sui campioni non trattati. Iniziare con l'aggiunta di reagente 2 ml di rilevamento per ogni sospensione cellulare. Immediatamente aggiungere 1 ml di sospensione cellulare / miscela dei reagenti di rilevamento per i tubi precedentemente preparato FACS con 1% paraformaldeide (0 minuti di tempo punto).
2. Incubare sospensioni cellulari con il reagente di rilevamento per 5 minuti a temperatura ambiente. Quindi aggiungere 1 ml di sospensione cellulare ad un tubo FACS con 1 ml di paraformaldeide 1%.
3. Continua incubando le sospensioni delle cellule con la miscela di rilevamento per altri 5 minuti a temperatura ambiente. Quindi aggiungere 1 ml di sospensione cellulare ad un tubo FACS con 1 ml di paraformaldeide 1%.
4. Ripetere il test calpaina sulle cellule 32Dkit che sono stati trattati con inibitori.
5. Fissare le cellule durante la notte al buio a 4 ° C.
6. Il giorno dopo agglomerare le cellule a 1800 giri per 5 minuti a 15 ° C.
7. Aspirare il sopranatante. Risospendere le cellule in 750uL PBS. Luogo cellule su ghiaccio e tenere al buio.

Acquisire dati per celle fisse

1. Analizzare le cellule utilizzando un II LSR (BD Bioscience). I filtri sono impostati per la Xcyte Lightwave (UV) laser, eccitazione 355nm linea e laser di potenza 25mW, emissione di 405 e 450 nm per il substrato e di prodotto, rispettivamente. Filtri passa banda per il substrato e di prodotto sono 405/20 e 450/50. Filtri passa lungo per il substrato e di prodotto sono 405 e 450. La tensione PMT è stato impostato sul 350-375 e 325-350 per il supporto per il prodotto.
2. Set-up un esperimento BD FACSDiva con i seguenti parametri: scatter in avanti; side scatter, Indo-1 Blu (log), Indo-1 Viola (log). Nel foglio di lavoro istituiti i seguenti grafici: forward scatter scatter plot vs lato dot con un cancello su cellule vive (Figura 1a), Indo-1 istogramma blu, Indo-1 istogramma Viola, Indo-1 vs Blu Indo-1 Viola dot plot.
3. Calibrare la II LSR con AlignFlow e AlignFlow più perline fluorescenti (Invitrogen). La tensione PMT deve essere regolato per posizionare il picco dell'istogramma tallone fluorescenza nel canale stesso prima di ogni esperimento.
4. Iniziare l'acquisizione dati utilizzando le cellule 32Dkit al punto 0 minuti di tempo. Regolare tensioni parametro, se necessario. Acquisire e registrare 10.000 eventi per ogni campione.
5. Ripetere l'acquisizione per ogni campione, il risciacquo la macchina con il tampone di FACS tra ciascun tubo.
6. Esportare i dati. Garantire LSR II viene pulito secondo le linee guida dell'istituto.

Saggio calpaina in cellule vive

1. Preparare le sospensioni cellulari come sopra, senza PD150606. Portare i campioni al II LSR e impostare filtri e parametri come sopra. Impostare il foglio di lavoro come sopra. Includono un grande appezzamento dot mostrando Indo-1 blu in funzione del tempo. Impostare il programma di acquisire il numero massimomero di eventi (non cancello stop).
2. Aggiungi 50 micron PD150606 ad una sospensione cellulare di cellule 32Dkit. Tenere il campione al buio e incubare a temperatura ambiente per 20-30 minuti.
3. Iniziare l'acquisizione dati sulla sospensione cellulare 32Dkit senza PD150606. Utilizzare un basso tasso di flusso di 200-300 eventi al secondo. Dopo 30 secondi a 1 minuto togliere il tubo dalla macchina. Aggiungi 20μM BOC-LM-CMAC alle cellule. Vortex brevemente poi proseguire l'acquisizione dei dati.
4. Acquisire dati per 10-20 minuti o fino a quando gli altipiani attività calpaina.
5. Ripetere i passaggi 3 e 4 con le cellule trattate con 32Dkit PD150606.
6. Esportare i dati. Garantire LSR II viene pulito secondo le linee guida dell'istituto.

Saggio calpaina in complesso (Misto) popolazioni di cellule

* Questo esperimento 32Dkit identificare le cellule in una sospensione di cellule prelevate da una milza del mouse.

1. Raccolto la milza da ogni mouse. Lisare il globulo rosso con NH ₄ Cl per 10 minuti a temperatura ambiente.
2. Preparare sospensioni singola cella in 2 ml di PBS.
3. Dividere ogni sospensione di cellule in due. Trattare 1 sospensione cellulare con 50 micron PD150606 per 20-30 minuti a temperatura ambiente al buio.
4. Procedere come sopra per il saggio Calpain nelle celle fisso (Fasi 1-6)
5. Aspirare il sopranatante. Lavare le cellule in 500μL PBS. Aspirare il sopranatante.
6. Risospendere le cellule in tampone di colorazione 200μL con il 2% BSA. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
7. Preparare l'anticorpo primario (FITC anti-topo CD117). L'anticorpo deve essere utilizzato a una diluizione 1:200 in colorazione buffer. Assicurarsi che l'anticorpo è tenuto all'oscuro.
8. Aggiungi 200μL anticorpo primario per le cellule. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente al buio.
9. Aggiungi 400μL PBS per aumentare il volume di citometria a flusso. Posizionare le cellule in ghiaccio e tenere al buio.
10. Procedere come descritto nella acquisizione dei dati per le celle fisso. Aggiungi FITC ai parametri e comprendono un istogramma per FITC sul foglio di lavoro.

Analisi e risultati rappresentativi

1. Analizzare i dati utilizzando FlowJo (Treestar). Cancello su cellule vive in base al profilo scatter in avanti e laterale (Figura 1a). Determinare la fluorescenza media per indo-blu dalla porta delle cellule vitali (Figura 1b).
2. a) Per la popolazione di cellule miste
   • uso FITC fluorescenza su parcelle istogrammi e punto per identificare la popolazione 32Dkit
   • Determinare la fluorescenza media per indo-blu della popolazione 32Dkit
3. Utilizzare Microsoft Excel per rappresentare graficamente la fluorescenza media (Figura 2a). Calcolare la pendenza della linea tra i 5 ei 10 minuti. Grafico la pendenza come un grafico a barre per determinare l'attività calpaina nelle cellule (Figura 2b).

Figura 1a. Determinazione cellule vive in base al profilo scatter in avanti e laterale.

Figura 1b. Variazione media fluorescenza nel corso di 10 minuti di tempo.

Figura 2a. Rappresentante grafico di fluorescenza media.

Figura 2b. Calpain attività nelle cellule 32Dkit con inibitori.

Discussion

L'attività calpaina in cellule 32Dkit fisse e vita è stato determinato in questo protocollo video. Il trattamento della linea cellulare con l'inibitore della calpaina PD150606 portato a completa inibizione dell'attività calpaina nelle cellule. Inoltre, il trattamento con l'inibitore MEK1 PD98059 portato a completa inibizione dell'attività calpaina nelle cellule. ERK è un importante attivatore di calpaina-2 ^3. Questi risultati suggeriscono che l'attività calpaina-2 è predominante nelle cellule 32Dkit. Lavori in corso nel nostro laboratorio sta studiando le conseguenze di attività calpaina elevato, ei contributi di calpaina-1 e calpaina-2 nella leucemia.

Questo protocollo dettagli del primo test di citometria a flusso basato per misurare i livelli di attività calpaina in cellule fisse e viventi e può essere utilizzato per comprendere il meccanismo di regolazione calpaina e il suo ruolo nei processi patologici utilizzando cellule intatte.

Questo protocollo può essere modificato per esaminare gli effetti degli inibitori o manipolazioni sulle attività del gene calpaina. Inoltre, questo test può essere utilizzato per misurare l'attività calpaina in una miscela complessa di cellule, come sangue del cordone ombelicale o per identificare e misurare l'attività della calpaina in sottoinsiemi di cellule isolate dalla milza.

Questo test non distingue tra attività generate da diverse isoforme della calpaina. Reagenti genetiche o farmacologiche che abbattere o inibire calpains specifico può essere utilizzato per risolvere questo problema.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS BOC-LM-CMAC 4% paraformaldehyde	Invitrogen		Dissolve 4g paraformaldehyde in 100mL PBS. In fume hood, heat sample with stirring until clear. Let cool then store at 4°C
PD150606	Invitrogen		Use freshly reconstituted PD150606 for maximal calpain inhibition.
PD98059	Cell Signaling Technology
AlignFlow, AlignFlow plus fluorescent beads FACS tubes	Invitrogen
LSR II	BD Biosciences		Supernatant of WEHI-3 cells is used as a source of IL-3 in these experiments. Each collection of WEHI-3 supernatant is titrated to determine the optimal concentration used for 32Dkit cell growth.