Medir a atividade das calpaínas em células fixas e Vivendo por citometria de fluxo

Summary

Este artigo irá detalhar o protocolo para medir a atividade das calpaínas em células fixas e vivendo por citometria de fluxo.

Abstract

Calpaínas são onipresentes intracelular, cálcio-sensíveis, cisteína proteases neutras

Protocol

Prepare Reagentes

Nota: Todos os PBS contém Ca ^{2 +} e Mg ^{2 +}

1. Reagente de detecção
   Adicionar 20Hm 7-amino-4-clorometil cumarina, t-BOC-Leucina-metionina amida (BOC-LM-CMAC) a temperatura ambiente PBS. Cada suspensão de células exigirá reagente de detecção 2 ml.
2. Paraformaldeído 1% (células fixas)
   Diluir solução stock 4% paraformaldeído em PBS à temperatura ambiente. Paraformaldeído 1mL alíquota de 1% a cada tubo FACS. Três tubos FACS são necessários para cada condição experimental (ex. 32Dkit, 32Dkit + PD150606, 32Dkit + PD98059 precisará de 9 tubos FACS)
3. PD150606 (inibidor da calpaína)
   Reconstituir PD150606 em DMSO para uma concentração final de 100mM. Proteger este reagente e todas as células tratadas com da luz para a duração do experimento.
4. PD98059 (MEK1 inibidor)
   Reconstituir PD98059 em DMSO para uma concentração final de 50mM.

Prepare Células

1. Cultivar células 32Dkit menos 5 x 10 ⁵ a 1 x 10 ⁶ células por ml em Opti-MEM meio suplementado com 5% de soro fetal bovino, WEHI-3 sobrenadante como fonte de IL-3 (ou qualquer outra fonte de IL-3, tais como a proteína recombinante), 0,1% 2-mercaptoetanol e antibióticos.
2. Coletar 12 x 10 ⁶ células 32Dkit em três tubos de 15mL Falcon (4 x 10 ⁶ células por tubo).
3. Agregar as células a 1000 RPM por 5 minutos a 15 ° C.
4. Aspirar o sobrenadante. Ressuspender as células em 2 mL PBS à temperatura ambiente.
5. Tratar uma suspensão de células com 50 ìm PD150606. Certifique-se a amostra é protegido da luz, cobrindo o tubo Falcon com papel alumínio. Vortex brevemente, em seguida, incubar por 20-30 minutos em temperatura ambiente no escuro.
6. Tratar da suspensão de células em segundo lugar com 20Hm PD98059. Placa de células em um prato de 35 milímetros de cultura de tecidos e incubar por 2 horas a 37 ° C.

Calpaína Ensaio em células fixas

1. Enquanto as amostras são incubadas com PD150606, começa o ensaio calpaína nas amostras não tratadas. Comece por adicionar o reagente de detecção de 2 ml para cada suspensão de células. Imediatamente adicionar 1mL da suspensão de células / mistura de reagentes de detecção para os tubos previamente preparado FACS com paraformaldeído 1% (0 ponto tempo minutos).
2. Incubar suspensões de células com o reagente de detecção por 5 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, adicione 1 mL da suspensão de células para um tubo com 1 mL FACS paraformaldeído 1%.
3. Continue a incubar a suspensões de células com a mistura de detecção para um adicional de 5 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, adicione 1 mL da suspensão de células para um tubo com 1 mL FACS paraformaldeído 1%.
4. Repita ensaio calpaína em células 32Dkit que foram tratados com inibidores.
5. Corrigir as células durante a noite no escuro a 4 ° C.
6. No dia seguinte, agregar as células a 1800 RPM por 5 minutos a 15 ° C.
7. Aspirar o sobrenadante. Ressuspender as células em 750uL PBS. Coloque as células no gelo e manter no escuro.

Aquisição de dados para células fixas

1. Analisar as células usando um LSR II (BD Bioscience). Os filtros são definidos para o Xcyte Lightwave (UV) laser, linha de excitação 355nm e potência do laser 25mW, emissão de 405 e 450 nm para substrato e produto, respectivamente. Filtros de banda passante para substrato e produto são 405/20 e 450/50. Filtros de passe longo para substrato e produto são 405 e 450. A tensão PMT foi fixado em 350-375 para o substrato e 325-350 para o produto.
2. Set-up um experimento FACSDiva BD com os seguintes parâmetros: dispersão para a frente; dispersão lateral; Indo-1 Blue (log); Indo-1 Violet (log). Na planilha configurar os seguintes gráficos: dispersão frente vs lado gráfico de pontos de dispersão com um portão de células vivas (Figura 1a), Indo-1 histograma Azul, Indo-1 histograma Violet, Indo-1 Blue vs Violet Indo-1 gráfico de pontos.
3. Calibrar o II LSR com AlignFlow e AlignFlow mais partículas fluorescentes (Invitrogen). A tensão PMT deve ser ajustada para colocar o pico do histograma talão de fluorescência no mesmo canal antes de cada experimento.
4. Começar a adquirir os dados usando as células 32Dkit no ponto de tempo 0 minuto. Ajustar tensões parâmetro como necessário. Adquirir e registrar 10 mil eventos por amostra.
5. Repita aquisição para cada amostra, enxaguar a máquina com tampão FACS entre cada tubo.
6. Exportar os dados. Garantir LSR II é limpo de acordo com as diretrizes do instituto.

Calpaína Ensaio em células vivas

1. Prepare as suspensões de células como acima, sem PD150606. Trazer as amostras para o II LSR e configurar filtros e parâmetros acima. Configure a planilha como acima. Incluir um gráfico de pontos grande mostrando Indo-1 Blue vs tempo. Definir o programa para adquirir o máximo de númerosmero de eventos (sem portão stop).
2. Adicionar 50 ìm suspensão de células PD150606 a uma das células 32Dkit. Manter a amostra no escuro e incubar a temperatura ambiente por 20-30 minutos.
3. Começar a adquirir dados sobre a suspensão de células 32Dkit sem PD150606. Use uma baixa taxa de fluxo de 200-300 eventos por segundo. Após 30 segundos a 1 minuto retire o tubo da máquina. Adicionar 20Hm BOC-LM-CMAC para as células. Vortex brevemente em seguida, continuar a aquisição dos dados.
4. Aquisição de dados por 10-20 minutos ou até os planaltos atividade calpaína.
5. Repita os passos 3 e 4 com as células tratadas com 32Dkit PD150606.
6. Exportar os dados. Garantir LSR II é limpo de acordo com as diretrizes do instituto.

Calpaína Assay no Complexo Populações (Mixed) Célula

* Esta experiência vai identificar as células 32Dkit em uma suspensão de células colhidas de um baço mouse.

1. Colheita do baço de cada rato. Lisar as células vermelhas do sangue com NH ₄ Cl por 10 minutos em temperatura ambiente.
2. Preparar suspensões única célula em 2 mL de PBS.
3. Divida cada suspensão de células em dois. Tratar uma suspensão de células com 50 ìm PD150606 por 20-30 minutos em temperatura ambiente no escuro.
4. Proceda como acima para o ensaio calpaína em células Fixo (Passos 1-6)
5. Aspirar o sobrenadante. Lavar as células em 500μL de PBS. Aspirar o sobrenadante.
6. Ressuspender as células em tampão coloração 200μL com BSA 2%. Incubar por 15 minutos em temperatura ambiente.
7. Prepare o anticorpo primário (anti-camundongo FITC CD117). O anticorpo deve ser utilizada na diluição de 1:200 na coloração buffer. Certifique-se o anticorpo é mantido no escuro.
8. Adicionar 200μL anticorpo primário para as células. Incubar por 30 minutos em temperatura ambiente no escuro.
9. Adicionar 400μL de PBS para aumentar o volume de citometria de fluxo. Coloque as células no gelo e manter no escuro.
10. Proceda conforme descrito em adquirir dados para Células Fixo. Adicionar FITC aos parâmetros e incluem um histograma para FITC na planilha.

Análise e Resultados Representante

1. Analisar os dados usando programa FlowJo (Treestar). Portão em células vivas com base no perfil de dispersão para a frente e lateral (Figura 1a). Determinar a fluorescência significa para Indo-Azul a partir do portão de células viáveis ​​(Figura 1b).
2. a) Para a população mista de células
   • uso de fluorescência FITC em parcelas de histogramas e de ponto para identificar a população 32Dkit
   • Determinar a fluorescência significa para Indo-Azul da população 32Dkit
3. Use Microsoft Excel para o gráfico de fluorescência média (Figura 2a). Calcule a inclinação da linha entre 5 e 10 minutos. Inclinação do gráfico como um gráfico de barras para determinar a atividade calpaína nas células (Figura 2b).

Figura 1a. Determinação de células vivas com base no perfil de dispersão para a frente e lateral.

Figura 1b. Variação média de fluorescência mais de 10 minutos curso de tempo.

Figura 2a gráfico. Representante da fluorescência média.

Figura 2b. Calpaína atividade em células 32Dkit com inibidores.

Discussion

A atividade de calpaína em células 32Dkit fixa e vivendo foi determinado neste protocolo de vídeo. Tratamento da linhagem de células com o inibidor de calpaína PD150606 resultou em inibição total da atividade calpaína nas células. Além disso, o tratamento com o inibidor MEK1 PD98059 resultou em inibição total da atividade calpaína nas células. ERK é um ativador principal de calpaína-2 ^3. Estes resultados sugerem que calpaína-2 é a atividade predominante nas células 32Dkit. Trabalhos em curso em nosso laboratório está investigando as conseqüências da atividade calpaína aumentou e as contribuições de calpaína-1 e calpaína-2 em leucemia.

Este protocolo de detalhes o primeiro ensaio de citometria de fluxo com base para medir os níveis de atividade das calpaínas em células fixas e vida e pode ser usado para entender o mecanismo de regulação calpaína e seu papel nos processos patológicos utilizando células intactas.

Este protocolo pode ser modificado para examinar os efeitos de inibidores ou manipulações gene calpaína sobre a atividade. Além disso, este ensaio pode ser utilizado para medir a atividade das calpaínas em uma mistura complexa de células, tais como sangue do cordão umbilical ou para identificar e medir a atividade das calpaínas em subpopulações de células isoladas do baço.

Este ensaio não faz distinção entre a atividade gerada por diferentes isoformas da calpaína. Reagentes genéticas ou farmacológicas que derrubar ou inibir calpains específico pode ser usado para abordar esta questão.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS BOC-LM-CMAC 4% paraformaldehyde	Invitrogen		Dissolve 4g paraformaldehyde in 100mL PBS. In fume hood, heat sample with stirring until clear. Let cool then store at 4°C
PD150606	Invitrogen		Use freshly reconstituted PD150606 for maximal calpain inhibition.
PD98059	Cell Signaling Technology
AlignFlow, AlignFlow plus fluorescent beads FACS tubes	Invitrogen
LSR II	BD Biosciences		Supernatant of WEHI-3 cells is used as a source of IL-3 in these experiments. Each collection of WEHI-3 supernatant is titrated to determine the optimal concentration used for 32Dkit cell growth.