Mesure de l'activité calpaïne dans des cellules fixées et de la Vie par cytométrie en flux

Summary

Cet article détaillera le protocole de mesure de l'activité calpaïne dans les cellules fixes et de vie en utilisant la cytométrie de flux.

Abstract

Les calpaïnes sont omniprésents intracellulaire, sensible au calcium, cystéine-protéases neutres

Protocol

Préparer des réactifs

Note: Tous PBS contient Ca ^{2 +} et Mg ^{2 +}

1. Réactif de détection
   Ajouter 20μM 7-amino-4-chlorométhyl coumarine, t-BOC-Leucine-méthionine amide (BOC-LM-CMAC) à la température ambiante du PBS. Chaque suspension cellulaire exigera réactif de détection 2mL.
2. Paraformaldéhyde 1% (cellules fixées)
   Diluer 4% paraformaldéhyde solution stock à la température ambiante du PBS. Paraformaldéhyde Aliquoter 1mL de 1% à chaque tube FACS. Trois tubes FACS sont requis pour chaque condition expérimentale (ex. 32Dkit, 32Dkit + PD150606, 32Dkit + PD98059 besoin de 9 tubes FACS)
3. PD150606 (inhibiteur de calpaïne)
   Reconstituer PD150606 dans le DMSO à une concentration finale de 100 mM. Protégez ce réactif et de toutes les cellules traitées avec elle de la lumière pendant la durée de cette expérience.
4. PD98059 (MEK1 inhibiteur)
   Reconstituer PD98059 dans le DMSO à une concentration finale de 50 mM.

Préparer les cellules

1. Cultiver des cellules 32Dkit à 5 x 10 ⁵ à 1 x 10 ⁶ cellules par millilitre dans les médias Opti-MEM supplémenté avec 5% de sérum bovin fœtal, WEHI-3 surnageant comme une source d'IL-3 (ou toute autre source d'IL-3 tels comme protéine recombinante), 0,1% de 2-mercaptoéthanol et des antibiotiques.
2. Prélever 12 x 10 ⁶ cellules dans des tubes Falcon 32Dkit trois 15mL (4 x 10 ⁶ cellules par tube).
3. Pellet les cellules à 1000 rpm pendant 5 minutes à 15 ° C.
4. Aspirer le surnageant. Resuspendre les cellules dans 2 ml de PBS température ambiante.
5. Traiter une suspension cellulaire avec 50 microns PD150606. S'assurer que l'échantillon est protégé de la lumière en couvrant le tube Falcon de papier d'aluminium. Vortex brièvement puis incuber pendant vingt à trente minutes à température ambiante dans l'obscurité.
6. Traiter la suspension cellulaire seconde avec 20μM PD98059. Assiette des cellules dans une boîte de culture tissulaire de 35 mm et incuber pendant 2 heures à 37 ° C.

Assay calpaïne dans des cellules fixées

1. Alors que les échantillons sont incubation avec PD150606, commencer le dosage calpaïne sur les échantillons non traités. Commencez par ajouter 2mL réactif de détection à chaque suspension cellulaire. Immédiatement ajouter 1ml de la suspension cellulaire / mélange de réactifs de détection pour les tubes préalablement préparé FACS avec du paraformaldéhyde 1% (0 point dans le temps minutes).
2. Incuber les suspensions cellulaires avec le réactif de détection pendant 5 minutes à température ambiante. Puis ajoutez 1 ml de la suspension cellulaire dans un tube à FACS avec 1mL paraformaldéhyde 1%.
3. Poursuivre l'incubation des suspensions cellulaires avec le mélange de détection pour un supplément de 5 minutes à température ambiante. Puis ajoutez 1 ml de la suspension cellulaire dans un tube à FACS avec 1mL paraformaldéhyde 1%.
4. Répéter test calpaïne sur les cellules 32Dkit qui ont été traités avec des inhibiteurs.
5. Fixer les cellules pendant la nuit dans l'obscurité à 4 ° C.
6. Le lendemain un culot cellulaire à 1800 rpm pendant 5 minutes à 15 ° C.
7. Aspirer le surnageant. Resuspendre les cellules dans 750uL PBS. Placez les cellules sur la glace et de garder dans l'obscurité.

Acquérir des données pour des cellules fixées

1. Analyser les cellules en utilisant une II LSR (BD Bioscience). Les filtres sont fixés pour l'Xcyte Lightwave (UV) au laser, ligne d'excitation 355nm 25mW et laser de puissance, l'émission de 405 et 450 nm pour le substrat et le produit respectivement. Filtres passe-bande pour le substrat et de produit sont 405/20 450/50 et. Filtres passe longue pour le substrat et de produit sont 405 et 450. La tension a été mis sur le PMT 350-375 pour le substrat et 325-350 pour le produit.
2. Mise en place d'une expérience BD FACSDiva avec les paramètres suivants: diffusion vers l'avant; diffusion latérale; indo-1 Blue (log); Indo-1 Violet (log). Sur la feuille de calcul mis en place les graphiques suivants: diffusion vers l'avant vs dot plot côté de dispersion avec une porte sur des cellules vivantes (figure 1a), indo-1 histogramme bleu, indo-1 histogramme Violet, indo-1 Blue vs indo-1 Violet dot plot.
3. Calibrer le LSR II avec AlignFlow et AlignFlow ainsi perles fluorescentes (Invitrogen). La tension PMT devrait être ajusté à placer le pic de l'histogramme de fluorescence billes dans le même canal avant chaque expérience.
4. Commencer à acquérir des données en utilisant les cellules 32Dkit au point 0 minutes de temps. Ajustez les tensions paramètre comme nécessaire. Acquérir et enregistrer 10.000 manifestations par échantillon.
5. Répétez l'acquisition pour chaque échantillon, le rinçage de la machine avec un tampon de FACS entre chaque tube.
6. Exporter les données. Assurez-LSR II est nettoyé conformément aux directives de l'institut.

Assay calpaïne dans des cellules vivantes

1. Préparer les suspensions de cellules comme ci-dessus, sans PD150606. Apportez les échantillons au LSR II et mettre en place des filtres et des paramètres comme ci-dessus. Mettre en place la feuille de calcul que ci-dessus. Inclure une dot plot grand format indo-1 bleu en fonction du temps. Régler le programme d'acquisition de la NUM maximalenombre d'événements (pas de porte d'arrêt).
2. Ajouter 50 microns PD150606 à une suspension cellulaire de cellules 32Dkit. Conserver l'échantillon dans l'obscurité et incuber à température ambiante pendant 20-30 minutes.
3. Commencer à acquérir des données sur la suspension cellulaire 32Dkit sans PD150606. Utilisez un faible débit de 200-300 événements par seconde. Après 30 secondes à 1 minute, retirer le tube de la machine. Ajouter 20μM BOC-LM-CMAC dans les cellules. Vortex brièvement puis continuer l'acquisition des données.
4. Acquérir des données pendant 10-20 minutes ou jusqu'à ce que les plateaux d'activité calpaïne.
5. Répétez les étapes 3 et 4 avec des cellules traitées avec 32Dkit PD150606.
6. Exporter les données. Assurez-LSR II est nettoyé conformément aux directives de l'institut.

Assay calpaïne dans le Complexe populations cellulaires (Mixte)

* Cette expérience permettra d'identifier les cellules 32Dkit dans une suspension de cellules récoltées à partir d'un rate de souris.

1. Récolte de la rate de chaque souris. Lyse des globules rouges avec NH ₄ Cl pendant 10 minutes à température ambiante.
2. Préparer les suspensions de cellules simples dans 2mL de PBS.
3. Diviser chaque suspension cellulaire en deux. Traiter une suspension cellulaire avec 50 microns PD150606 pendant 20-30 minutes à température ambiante dans l'obscurité.
4. Procédez comme précédemment pour le dosage de la calpaïne dans des cellules fixes (étapes 1-6)
5. Aspirer le surnageant. Laver les cellules dans 500μL de PBS. Aspirer le surnageant.
6. Resuspendre les cellules dans un tampon de coloration 200 pl avec BSA 2%. Incuber pendant 15 minutes à température ambiante.
7. Préparer l'anticorps primaire (FITC anti-souris CD117). L'anticorps doit être utilisé à une dilution 1:200 dans la coloration de mémoire tampon. Assurer l'anticorps est maintenu dans l'obscurité.
8. Ajouter 200 ul d'anticorps primaires pour les cellules. Incuber pendant 30 minutes à température ambiante dans l'obscurité.
9. Ajouter 400μL de PBS pour augmenter le volume pour la cytométrie de flux. Placez les cellules sur la glace et de garder dans l'obscurité.
10. Procédez comme décrit dans l'acquisition de données pour les cellules fixes. Ajouter FITC aux paramètres et notamment un histogramme pour FITC sur la feuille de calcul.

Analyse et résultats représentatifs

1. Analyser les données en utilisant FlowJo (Treestar). Porte sur des cellules vivantes en fonction du profil de dispersion vers l'avant et de côté (figure 1a). Déterminer la moyenne de fluorescence pour les Indo-bleu de la porte de cellules viables (figure 1b).
2. a) Pour la population de cellules mixtes
   • l'utilisation fluorescence FITC sur des parcelles histogrammes et dot pour identifier la population 32Dkit
   • Déterminer la moyenne de fluorescence pour les Indo-bleu de la population 32Dkit
3. Utilisez Microsoft Excel pour représenter graphiquement la moyenne de fluorescence (figure 2a). Calculer la pente de la ligne entre 5 et 10 minutes. Graphique de la pente comme un diagramme pour déterminer l'activité calpaïne dans les cellules (Figure 2b).

Figure 1a. Déterminer les cellules vivantes en fonction du profil de dispersion avant et latérale.

Figure 1b. Variation moyenne de fluorescence plus de 10 cours du temps minute.

Figure 2a. Représentant graphique de la fluorescence moyenne.

Figure 2b. Activité de la calpaïne dans les cellules avec des inhibiteurs 32Dkit.

Discussion

L'activité calpaïne dans les cellules 32Dkit fixe et la vie a été déterminée dans ce protocole vidéo. Traitement de la lignée cellulaire avec l'inhibiteur de calpaïnes PD150606 entraîné une inhibition complète de l'activité calpaïne dans les cellules. En outre, le traitement avec l'inhibiteur de MEK1 PD98059 entraîné une inhibition complète de l'activité calpaïne dans les cellules. ERK est un important activateur de la calpaïne-2 ^3. Ces résultats suggèrent que l'activité calpaïne-2 est prédominante dans les cellules 32Dkit. Les travaux actuels dans notre laboratoire étudie les conséquences de l'activité calpaïne augmenté et les contributions de la calpaïne-1 et la calpaïne-2 dans la leucémie.

Ce protocole décrit le premier flux cytométrique dosage basé à mesurer les niveaux d'activité calpaïne dans les cellules fixes et vivante et peuvent être utilisées pour comprendre le mécanisme de règlement des calpaïnes et son rôle dans les processus pathologiques en utilisant des cellules intactes.

Ce protocole peut être modifié afin d'examiner les effets des inhibiteurs ou des manipulations génétiques sur l'activité calpaïne. En outre, ce test peut être utilisé pour mesurer l'activité calpaïne dans un mélange complexe de cellules telles que le sang du cordon ou d'identifier et de mesurer l'activité calpaïne dans des sous-ensembles de cellules isolées de la rate.

Ce test ne fait pas de distinction entre l'activité générée par différentes isoformes de calpaïnes. Réactifs génétiques ou pharmacologiques qui renverser ou inhiber les calpaïnes spécifiques peuvent être utilisés pour traiter cette question.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS BOC-LM-CMAC 4% paraformaldehyde	Invitrogen		Dissolve 4g paraformaldehyde in 100mL PBS. In fume hood, heat sample with stirring until clear. Let cool then store at 4°C
PD150606	Invitrogen		Use freshly reconstituted PD150606 for maximal calpain inhibition.
PD98059	Cell Signaling Technology
AlignFlow, AlignFlow plus fluorescent beads FACS tubes	Invitrogen
LSR II	BD Biosciences		Supernatant of WEHI-3 cells is used as a source of IL-3 in these experiments. Each collection of WEHI-3 supernatant is titrated to determine the optimal concentration used for 32Dkit cell growth.