Sabit ve Yaşam Hücreler Sitometrisi ile Calpain Aktivitesi Ölçme

Summary

Bu makale, flow sitometri kullanarak sabit ve canlı hücrelerin calpain aktivitesini ölçmek için ayrıntılı protokol.

Abstract

Calpains her yerde hücre içi kalsiyum duyarlı, nötr sistein proteazlar

Protocol

Reaktifler hazırlayın

Not: Tüm PBS içeren Ca ^{2 +} ve Mg ^{2 +}

1. Algılama Reaktif
   Oda sıcaklığında PBS 20μM 7-amino-4-klorometil kumarin, t-BOC-Leucine-metiyonin amid (BOC-LM-CMAC) ekleyin. Her bir hücre süspansiyonu 2mL algılama reaktif gerekecektir.
2. % 1 Paraformaldehit (Sabit Hücreler)
   Oda sıcaklığında PBS içinde% 4 paraformaldehid stok çözeltinin. % 1 ml 1 paraformaldehid her FACS tüp kısım. Üç FACS tüpleri her deneysel koşul için gereklidir (örneğin 32Dkit, 32Dkit + PD150606, 32Dkit + PD98059 9 FACS tüpleri gerekir)
3. PD150606 (calpain inhibitörü)
   100 mM nihai konsantrasyonu DMSO içinde sulandırın PD150606. Bu reaktif ve bu deney süresi boyunca ışık ile tedavi edilen tüm hücreleri koruyun.
4. PD98059 (MEK1 inhibitörü)
   50mm son konsantrasyonu DMSO sulandırın PD98059.

Hücreler hazırlayın

1. 5 x 10 Opti-MEM medya ml başına 1 ila ⁵ x 10 ⁶ hücre% 5 fetal sığır serumu, WEHI-3, IL-3 kaynağı (IL-3 gibi herhangi bir başka kaynak olarak süpernatant ile desteklenmiş 32Dkit hücrelerin büyümesine rekombinant protein gibi),% 0.1 'i 2-merkaptoetanol ve antibiyotikler.
2. Üç 15 mL Falcon tüpleri (tüp başına 4 x 10 ⁶ hücre), 12 x ¹⁰ 6 32Dkit hücreleri toplayın .
3. 15 yaşında 5 dakika boyunca 1000 RPM Pelet hücreleri ° C
4. Süpernatant aspire. 2mL oda sıcaklığında PBS içinde hücreler tekrar
5. 50μM PD150606 bir hücre süspansiyonu davranın. Örnek Falcon tüp alüminyum folyo ile kaplayarak ışıktan korumalı olduğundan emin olun. Vortex karanlıkta, oda sıcaklığında kısa bir süre sonra yirmi ila otuz dakika boyunca inkübe edin.
6. 20μM PD98059 ile ikinci hücre süspansiyonu davranın. Plaka 37, 2 saat boyunca 35mm doku kültürü çanak ve inkübe hücrelerin ° C

Sabit Hücreler Calpain Testi

1. Örnekleri PD150606 kuluçka calpain tahlil, tedavi edilmeyen numuneler üzerinde başlar. Her hücre süspansiyonu 2mL algılama reaktif ekleyerek başlayın. % 1 paraformaldehid (0 dakika zaman noktası) ile hemen önceden hazırlanmış FACS tüpler için 1 ml hücre süspansiyonu / algılama reaktif karışımı ekleyin.
2. Hücre süspansiyonları oda sıcaklığında 5 dakika boyunca algılama reaktifi ile inkübe edin. Daha sonra 1 ml% 1 paraformaldehid ile hücre süspansiyonu FACS tüpüne 1 ml ekleyin.
3. Algılama karışımı ile hücre süspansiyonları ek bir 5 dakika oda sıcaklığında inkübe devam edin. Daha sonra 1 ml% 1 paraformaldehid ile hücre süspansiyonu FACS tüpüne 1 ml ekleyin.
4. Inhibitörleri ile tedavi edilmiştir 32Dkit hücreleri calpain tahlil tekrarlayın.
5. Fix karanlık gecede hücreleri 4 ° C
6. Ertesi gün pelet 5 dakika boyunca 1800 RPM hücreleri 15 ° C
7. Süpernatant aspire. 750uL PBS hücrelerin yeniden süspanse edin. Buz üzerinde hücrelerini koyun ve karanlıkta tutmak.

Sabit Hücreleri için Veri Edinme

1. LSR II (BD Bioscience) kullanarak hücrelerin analiz edin. Filtreler Lightwave Xcyte (UV) lazer, uyarma hattı 355nm ve lazer gücü 25mW, substrat ve ürün için sırasıyla 405 ve 450 nm emisyon için ayarlanır. Substrat ve ürün Band geçiren filtreler, 405/20 ve 450/50. Uzun geçiren filtreler substrat ve ürün için 405 ve 450. PMT gerilim ürün için substrat için 350-375 ve 325-350 kurulmuştur.
2. Yan dağılım; Hint-1 Mavi (log); Mor Hint-1 (log) forward scatter: Aşağıdaki parametreler ile BD FACSDiva deney set-up. Forward scatter canlı hücreler üzerinde kapısı (Şekil 1a), Hint-1 Mavi histogram, Hint-1 Mor histogram, Hint-1 Mavi vs Hint-1 Menekşe ile yan dağılım nokta arsa vs: Çalışma sayfasında aşağıdaki grafikler nokta arsa.
3. LSR AlignFlow ve AlignFlow II artı floresan boncuk (Invitrogen) kalibre edin. PMT gerilim her deneyde önce aynı kanalda boncuk floresan histogramın zirvesine yerleştirmek için ayarlanabilir olmalıdır.
4. 0 dakika zaman noktada 32Dkit hücreleri kullanarak veri edinme başlayın. Gerekli parametre gerilimler ayarlayın. Edinin ve örnek başına 10.000 olayları kaydetmek.
5. Her tüp arasındaki FACS tamponu ile makine durulama, her bir numune için elde tekrarlayın.
6. İhracat verileri. Emin olun LSR II enstitü kurallarına göre temizlenir.

Canlı Hücrelerde Calpain Testi

1. Hiçbir PD150606, yukarıdaki gibi hücre süspansiyonları hazırlayın. LSR II örnekleri getirin ve yukarıdaki gibi filtreler ve parametrelerini ayarlamak. Yukarıdaki gibi çalışma sayfası ayarlayın. Hint-1 Mavi vs gösteren büyük bir nokta arsa dahil. Maksimum sayı elde etmek için programı ayarlayabilirsiniz.olaylar ber (durak kapısı).
2. 32Dkit hücreleri 50μM PD150606 bir hücre süspansiyonu ekleyin. Karanlıkta örnek tutun ve 20-30 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
3. Hiçbir PD150606 32Dkit hücre süspansiyonu elde başlayın. Düşük akış hızı saniyede 200-300 olayların kullanın. Tüp 30 saniye ile 1 dakika sonra makineden çıkarın. 20μM BOC-LM-CMAC hücrelere ekleyin. Vortex kısa bir süre sonra veri edinmeye devam.
4. 10-20 dakika veya calpain etkinliği yaylalarda kadar veri elde.
5. PD150606 ile tedavi 32Dkit hücreleri ile 3. ve 4. adımları tekrarlayın.
6. İhracat verileri. Emin olun LSR II enstitü kurallarına göre temizlenir.

Kompleks (Karışık) Cep Popülasyonlar Calpain Testi

* Bu deney, bir fare dalak hasat bir hücre süspansiyonu 32Dkit hücreleri belirleyecektir.

1. Hasat her fare dalak. NH ₄ Cl ile oda sıcaklığında 10 dakika süreyle kırmızı kan hücresi Lyse.
2. 2mL PBS tek hücre süspansiyonları hazırlayın.
3. Her iki hücre süspansiyonu bölün. 20-30 dakika karanlıkta, oda sıcaklığında 1 hücre süspansiyonu 50μM PD150606 davranın.
4. Sabit Hücrelerde Calpain Assay (Adımlar 1-6) için yukarıda açıklandığı gibi devam edin
5. Süpernatant aspire. 500μL PBS hücrelerin yıkayın. Süpernatant aspire.
6. % 2 BSA ile 200μL boyama tamponu hücrelerin tekrar Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
7. Birincil antikor (FITC anti-fare CD117) hazırlayın. Antikor tampon boyama 1:200 dilüsyon kullanılmalıdır. Antikor karanlıkta tutulur emin olun.
8. Hücrelere 200μL primer antikor ekleyin. Karanlık oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
9. Flow sitometri için hacmini artırmak 400μL PBS ekleyin. Hücreleri buz koyun ve karanlıkta tutmak.
10. Sabit Hücreleri için Veri Edinme açıklandığı gibi devam edin. Parametrelere FITC ekleyin ve FITC için çalışma sayfasındaki bir histogram dahil.

Analiz ve Temsilcisi Sonuçlar

1. FlowJo (Treestar) kullanarak verileri analiz edin. Ileri ve yan dağılım profili (Şekil 1a) göre canlı hücreler üzerinde Kapısı. Canlı hücre kapısı (Şekil 1b) Hint-Blue ortalama floresan belirleyin.
2. Karışık Hücre Nüfus a)
   • 32Dkit nüfusu tanımlamak için histogramlar ve nokta araziler FITC floresanı
   • Hint-Mavi 32Dkit nüfusun ortalama floresan belirleyin
3. Microsoft Excel grafik ortalama floresan (Şekil 2a) kullanın. 5 ve 10 dakika arasında çizginin eğimi hesaplayın. Grafik eğimi (Şekil 2b) hücrelerinde calpain etkinliğini belirlemek için bir çubuk grafik olarak.

Şekil 1a ileri ve yan dağılım profiline göre canlı hücreler belirlenmesi.

Şekil 1b 10 dakikalık bir süre boyunca ortalama floresan değişimi.

Şekil 2a ortalama floresan Temsilcisi grafik.

Inhibitörleri ile 32Dkit hücreler Şekil 2b. Calpain aktivite.

Discussion

Bu video protokolü sabit ve yaşam 32Dkit hücrelerinde calpain aktivite tespit edilmiştir. Calpain inhibitörü PD150606 ile hücre hattı Tedavi, hücrelerin calpain aktivitesinin inhibisyonu ile sonuçlandı. Buna ek olarak, MEK1 inhibitörü PD98059 tedavisi, hücrelerin calpain aktivitesinin inhibisyonu ile sonuçlandı. ERK calpain-2 ⁽³⁾ büyük bir aktivatör. Bu sonuçlar calpain-2 aktivitesinin 32Dkit hücreleri baskın olduğunu düşündürmektedir. Laboratuvarımızda Şu çalışmalar artmış calpain aktivite lösemi calpain-1 ve calpain-2 sonuçları ve katkıları araştırıyor.

Bu protokol, sabit ve canlı hücrelerin calpain aktivite düzeylerini ölçmek için ilk akım sitometrik bazlı analiz ve calpain düzenleme ve sağlam hücreler kullanılarak patolojik süreçlerin rolünü mekanizmasını anlamak için kullanılabilir.

Bu protokol calpain faaliyet inhibitörleri veya gen manipülasyonları etkilerini incelemek için modifiye edilebilir. Buna ek olarak, bu testte hücreler, kordon kanı veya dalak izole hücre alt calpain aktivitesini belirlemek ve ölçmek için karmaşık bir karışımı calpain aktivitesini ölçmek için kullanılabilir.

Bu testte, calpain farklı izoformları tarafından üretilen aktivitesi arasında ayırım yapmaz. Bu sorunu gidermek için özel calpains yıkmak veya inhibe Genetik veya farmakolojik reaktifler kullanılabilir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS BOC-LM-CMAC 4% paraformaldehyde	Invitrogen		Dissolve 4g paraformaldehyde in 100mL PBS. In fume hood, heat sample with stirring until clear. Let cool then store at 4°C
PD150606	Invitrogen		Use freshly reconstituted PD150606 for maximal calpain inhibition.
PD98059	Cell Signaling Technology
AlignFlow, AlignFlow plus fluorescent beads FACS tubes	Invitrogen
LSR II	BD Biosciences		Supernatant of WEHI-3 cells is used as a source of IL-3 in these experiments. Each collection of WEHI-3 supernatant is titrated to determine the optimal concentration used for 32Dkit cell growth.