Dechorionation d'embryons Medaka et la transplantation de cellules pour la production de chimères

Summary

En raison de la chorion dur et d'embryons non alcoolisées, la manipulation d'embryons de medaka est plus compliqué que chez le poisson zèbre. Cette vidéo montre étape par étape, les procédures pour la manipulation des embryons de medaka, y compris dechorionation, montage d'agarose pour l'imagerie et la transplantation de cellules pour la production de chimères. Ces procédures sont essentielles à utiliser le medaka et poisson-zèbre dans un laboratoire de tirer pleinement parti de leur complémentarité pour la dissection génétique des fonctions du génome des vertébrés.

Abstract

Medaka est un petit poisson d'eau douce de ponte qui permet des analyses génétiques et embryologiques et est l'un des trois organismes modèles vertébrés dans lequel l'ensemble du génome phénotype axées sur les écrans mutantes ont été effectuées ^1. Divergence de chevauchement fonctionnel de gènes liés entre medaka et poisson-zèbre permet l'identification de nouveaux phénotypes qui sont identifiables dans une seule espèce ^2, ainsi medaka et poisson zèbre sont complémentaires pour la dissection génétique des génomes de vertébrés fonctions. La manipulation des embryons de medaka, comme dechorionation, les embryons de montage pour l'imagerie et la transplantation de cellules, sont les principales procédures de travailler à la fois sur le medaka et poisson-zèbre dans un laboratoire. La transplantation de cellules examine l'autonomie cellule de mutations medaka. Les chimères sont générés par la transplantation de cellules marquées à partir d'embryons donateurs dans des embryons receveurs non étiquetés. Les cellules donneuses peuvent être transplantés à des domaines spécifiques des embryons receveurs basées sur le sort cartes ³

Protocol

1. Développement des embryons

1. Quand ils sont pondus, les œufs sont regroupés en raison de filaments de fixation sur le chorion. Pour que les embryons se développent normalement, il est nécessaire de séparer les oeufs. Tangle et couper les filaments de fixation en maintenant les filaments de fixation avec deux pinces.
2. Après unclustering, les oeufs sont séparés de fèces et d'algues et transférées dans un milieu d'embryons frais à une densité maximum de 40 œufs par 6cm boîte de Petri.
3. Embryons de medaka développer un peu plus lent que le poisson-zèbre à 27 ° C. Le moment de l'éclosion est différente entre les deux espèces; embryons de medaka éclosion du chorion en 7 jours et immédiatement commencer à nager et manger, alors embryons de poisson zèbre éclosent au bout de 2 jours, mais commencent à nager et de manger dans les 5-6 jours. Développement de medaka est mis en scène selon la mise en scène Iwamatsu ^4.
4. Le développement des embryons de medaka peuvent être facilement ajustés aux plans expérimentaux en sélectionnant letempérature. Développement des embryons de medaka peut être arrêté à 4 ° C en début de développement. Après l'étape 24, lorsque battements du cœur commence, le développement peut être ralenti en utilisant une température minimale de 18 ° C.
5. Le moment d'apparition des organes / tissus est légèrement différente dans medaka rapport avec le poisson zèbre, c'est à dire dans somitogenèse medaka survient après le début du développement du cerveau alors que dans le poisson-zèbre somitegenesis précède le développement du cerveau.

2. Retrait du chorion

Le chorion de medaka compose de deux couches de protection à l'intérieur d'une couche dure et une surface extérieure souple. Ainsi, un traitement à la protéase en deux étapes en utilisant la pronase et enzyme d'éclosion est nécessaire de supprimer ce chorion.

Une fois dechorionated, les embryons doivent être conservés en 1X BSS. Semi-stériles conditions permettra d'améliorer la culture d'embryons dechorionated succès, surtout lorsque les périodes d'observation plus longues sont nécessaires. Il s'agit notamment deen utilisant des solutions stériles (stérilisés par exemple 1X BSS avec des antibiotiques) et des outils stérilisés avec de l'éthanol 70% puis rinçage à l'1X BSS.

Comme dechorionated embryons de medaka sont plus doux et plus fragiles que les embryons de poisson zèbre dechorionated, des précautions supplémentaires doivent être prises pour veiller à ce qu'ils n'entrent pas en contact de l'air ou de bulles dans la pipette, au risque de provoquer l'effondrement immédiat. Afin de garantir un minimum de dommages aux embryons, une pipette à large goulot de la chaleur en verre poli avec pompe à pipette doit être utilisée pour le transfert d'embryons et une boucle de cheveux doivent être utilisés pour orienter embryons pour l'observation. Non adhérentes boîtes de Petri doivent être utilisés pour prévenir les embryons de se fixer aux surfaces.

1. Avant dechorionation il faut vérifier que les œufs ont été suffisamment séparés et nettoyés.
2. Étant donné que la pronase et des enzymes d'incubation sont protéinases, ils doivent être conservés sur de la glace et de minimiser l'exposition des embryons de ces enzymes.
3. Transfert des œufs à sandpapar (p2000 grain, imperméable à l'eau) placé dans le couvercle d'une boîte de Pétri 9cm. Retirer milieu en excès, mais d'assurer un volume suffisant demeure pour empêcher le dessèchement des embryons.
4. Roulez doucement embryons pendant environ 45-60 secondes pour enlever une partie des poils de surface extérieure et légèrement entailler la surface du chorion (Figure 1). Transfert d'embryons revenir à une boîte de Pétri d'origine et d'examiner.
   
   Lorsque vous roulez sur du papier de verre embryons utiliser l'index, en appliquant une pression minimale et le maintien doigt parallèlement à la surface du papier de verre. Ne pas rouler plus de 5-7 embryons à la fois. Cette précaution permettra de minimiser les risques d'écrasement embryons dessous de l'autre.
   
   
5. Remplacer milieu à l'œuf dans un plat avec de la pronase 20mg/ml et d'embryons incuber pendant 40-60 minutes à 27 ° C.
   
   Assurer embryons sont suffisamment couverts par la pronase et un couvercle est présent sur le plat. Pronase utilisé doit être conservé sur de la glace au cours de cette étape à mitienne pas compte d'auto-digestion et peut être réutilisé jusqu'à ce que l'activité est perdue (environ 1-2 semaines).
   
   
6. Récupérer pronase pour les embryons de réutilisation et de lavage 5X en milieu embryon pour éliminer les traces de pronase car cela inactiver l'enzyme d'éclosion à ajouter.
7. Retirer moyen d'embryons et d'embryons de couverture avec l'enzyme d'éclosion, les embryons assurant siéger en tant que monocouche dans le plat.
   
   Si les œufs s'asseoir sur le dessus les uns des autres dans le plat, ceux d'en bas seront écrasés comme le chorion se dissout. Gardez enzyme d'éclosion utilisé sur la glace.
   
   
8. Incuber les embryons à 27 ° C et après 15 minutes de vérifier périodiquement l'état d'avancement de l'éclosion à l'aide d'un stéréomicroscope.
   
   On verra qu'un certain nombre de cratère lunaire-comme les trous commencent à apparaître dans la couche interne du chorion, qui se dissout rapidement suite à cette sortie de la couche externe souple du chorion facilement enlevé manually. L'ensemble du processus d'éclosion peut prendre 15-60 minutes.
   
   
9. Dès que les embryons sortent du chorion, transférer des embryons à une boîte de Pétri contenant 1X BSS.
   
   Assurez-vous de ne pas transférer enzyme d'éclosion au BSS 1X en touchant la pointe de la pipette sur la surface de la BSS permettant aux embryons à rouler doucement sur.
   
   
10. Une fois que tous les embryons sont transférés à partir enzyme d'éclosion, faire un transfert définitif vers un autre plat frais de 1X BSS.
    
    Cela garantit embryons ne sont pas exposés à des restes de l'enzyme d'éclosion, car cela pourrait endommager les embryons exposés. Une fois dans ce plat final des embryons encore qui possèdent la couche externe du chorion peut être libéré manuellement à l'aide de micro-pinces stérilisées sous la loupe binoculaire.
    
    Si les embryons doivent être développées dechorionation suivante, pénicilline / streptomycine doit être ajouté àle BSS à empêcher la croissance bactérienne.
    
    

Figure 1. Comparaison des embryons laminés et déroulé pendant dechorionation. Observez comment les embryons laminés dans le groupe B n'ont pas les poils visibles sur les embryons déroulé dans le panneau A.

3. Montage embryons dechorionated

Intégration d'agarose est utile pour des périodes plus longues de l'imagerie (par exemple, imagerie time-lapse) pour les embryons vivants ainsi que pour les observations détaillées des embryons fixes. Au cours de la gastrulation et organogenèse précoce (stade 14 au stade 28), les embryons de medaka présentent des vagues de mouvements rythmiques contractiles à travers le périderme, une couche de tissu qui recouvre à la fois le développement de l'embryon et le jaune ^5. Les embryons sont traités avec 3,5 mm 1-heptanol pour arrêter les mouvements contractiles ^6.

Pour arrêter le mouvement d'embryons après stage 28 (64hpf), les embryons sont anesthésiés en ajoutant des gouttes de tricaïne mésilate (TMS) avant enrobage. TMS est également ajouté à la gélose (ajouter seulement une quantité minimale, cette dose doit être optimisé, environ une dilution 1:25).

1. Décongeler une petite quantité de 3% d'agarose à basse température de gélification (en 1X BSS) en chauffant à 37 ° C et maintenir à cette température.
2. Les étapes suivantes doivent être réalisées rapidement afin que l'agarose ne pas se solidifier avant d'orienter l'embryon. On utilise un support de verre à large ouverture pipette agarose fondu suffisamment pour remplir la dépression bouchon d'un tube Eppendorf.
3. Transfert d'un embryon dechorionated à la dépression bouchon en minimisant transportant plus de BSS avec l'embryon. Immédiatement absorption de l'agarose et de l'embryon de la dépression bouchon et le transfert vers une chambre de Petri boîte de culture.
   
   Un plat de 3.5cm de Pétri avec une fenêtre en verre au fond est utilisé. Pour l'imagerie à l'aide d'un microscope inversé,embryons sont face vers le bas et orientée vers le corps placé tout près de la vitre de protection. Pour l'imagerie à l'aide d'un microscope droit, l'épaisseur de l'agarose est minimisée.
   
   
4. Placer la capsule 3.5cm de Petri dans un plat de diamètre 14cm de glace de Petri contenant et l'eau (eau rempli à environ 1/3 profondeur totale de grand plat). Tout en maintenant la chambre fermement sur le fond de la boîte de Petri 14 cm, utiliser une boucle de cheveux pour orienter doucement l'embryon tel que souhaité dans le agarose fondu et maintenir l'embryon jusqu'à l'agarose se solidifie par un léger soulèvement et d'abaissement de la petite cuvette dans sa position initiale dans l'eau glacée.

4. La transplantation de cellules dans des embryons de medaka

Le but de cette procédure est de déterminer si le gène d'intérêt agit cellule autonome (dans une cellule) ou non cellulaire autonome (entre les cellules).

Les cellules donneuses peuvent être marqués avec un colorant traceur tel que la rhodamine-dextran avant transplantation (tel que décrit dans «La micro-injection d'embryons Medaka« le protocole d'accompagnement JoVE) ou une souche transgénique avec une expression de GFP peut être utilisé, permettant une évaluation de transplantation. Une combinaison des deux techniques de marquage est souvent utile pour surmonter l'auto-fluorescence qui peuvent être rencontrées. Pour time-lapse études après la transplantation, expression de la GFP est particulièrement utile.

Utiliser une pipette en verre à large ouverture avec pompe à pipette long de cette procédure et stériliser tous les outils (y compris les diapositives) au préalable avec EtOH à 70%, suivi par un rinçage soigneux avec 1X stérile BSS. Embryons receveurs sont généralement développés autour de la 12e étape car cela permet la discrimination des pôles ventrales et dorsales lors de la réalisation de transplantation.

1. Commencer dechorionating embryons 1,5 heure avant la transplantation et dispositif d'injection de configuration au cours d'incubations enzymatiques.
2. Placez une lame de microscope cavité dans une boîte de Pétri de diamètre 9cm. Ajouter une petite quantité de méthylcellulose 3% vers le centre de la diapositive cavité à l'aide d'une pipette stérile et éparpillé.
3. Méthylcellulose à sec pendant environ 1-2 minutes.
4. Ajouter 350μl de 1X stérile BSS pour combler la dépression diaporama.
5. Transfert d'un embryon donneur et un maximum de quatre embryons receveurs de la lame à l'aide d'une pipette en verre.
6. Orienter les embryons en utilisant une boucle des cheveux de sorte que le blastoderme de l'embryon est orienté vers le haut.
   
   Les embryons peuvent être appuyé contre l'autre pour augmenter la stabilité ultérieure.
   
   
7. Insérez délicatement l'aiguille en micro-blastoderme donateurs et lentement absorption 10-20 cellules.
8. Insérez doucement l'aiguille dans la zone requise du blastoderme embryon receveur et d'expulser les cellules lentement. Un grand soin doit être pris lors de l'insertion dans les cellules du blastoderme destinataire afin de ne pas perturber la cellule vitelline frontière car cela peut entraîner la mort de l'embryo.
9. Verser stérilisés 1X BSS dans la boîte de Pétri.
   
   Versez délicatement le SRS dans le plat le plus près possible du côté du plat que possible afin de ne pas perturber les embryons. Ne versez jamais le BSS directement sur les embryons et ajouter suffisamment BSS tels que le coulisseau et embryons sont immergés.
   
   
10. Ajouter 100 pi de pénicilline / streptomycine dans le plat et le couvercle. Transférer délicatement plat dans un incubateur à 27 ° C pour permettre un développement normal.
11. Les embryons peuvent être observés régulièrement comme vous le souhaitez. Lorsque vous utilisez la transplantation d'effectuer gain-de-fonction et / ou expériences de sauvetage phénotype, certains changements morphologiques observés pourraient être dus à des effets de la transplantation. Ainsi transplantations multiples sont nécessaires. Après 2-3 jours, mélanophores doivent être présents sur le sac vitellin, la tête, les yeux et le tronc. Si elle est présente sur les embryons transplantés alors un succès chimère a probablement été produite (figure 3).

5. Les résultats représentatifs

Exemple de position figure 2. D'un embryon d'agarose-embedded. Antérieur est illustré à droite et la vue est dorsale. Groupe B: les cellules endothéliales peut être vu des deux côtés du corps embryonnaire et sont étiquetés en utilisant la GFP dirigée par le promoteur fli.

Figure 3. Images de post-transplantation d'embryons. Une image montre un donneur et receveur embryon immédiatement après la transplantation. L'embryon donneur est indiquée sur la droite avec un blastoderme complètement rouge (flèche). L'embryon receveur est indiqué sur ee à gauche et est facilement identifié par la petite masse de cellules transplantées rouges visibles dans le blastoderme (tête de flèche). B L'image montre deux embryons receveurs d'environ 7 heures après la transplantation (incubé à 27 ° C). Notez que les cellules transplantées ont migré à partir du site de la transplantation et sont aujourd'hui dispersés à travers le blastoderme (flèches). Image C montre un embryon receveur à st.29 (environ 74hpf). Notez la pigmentation dans les yeux et la présence de mélanophores dans le coffre et la région du cerveau (flèches). Les cellules marquées à la rhodamine peut être vu à coloniser de nombreuses structures embryonnaires indiquant le succès de la production d'une chimère.

Discussion

Dans cette vidéo, nous démontrons comment dechorionate et effectuer transplanataion cellules sur des embryons de medaka. Il s'agit d'une technique puissante pour produire des embryons chimériques pour l'étude du gène / protéine de fonction au cours du développement, ainsi que pour élucider l'autonomie du gène / protéine en question. Medaka constituent un système modèle vertébré utiles pour cette technique en raison de cartes sort bien établies et leur transparence, leur bien prêt à in vivo imagerie en temps réel. La transplantation peut être combiné avec micro-injection (tel que décrit dans «micro-injection d'embryons Medaka« le protocole d'accompagnement JoVE) de sorte que le comportement des cellules transplantées peuvent être facilement observés.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Embryo medium	Reagent	Made in-house	N/A	200ml 50X stock solution, 1ml 1%methyleneblue in H2O/10 liter RO water (50X stock solution: NaCl 14.7g, KCl 0.6g, CaCl2 2H2O 2.4g, MgSO4 7H2O 4.0g/1 litre RO water.)
Micro-dissecting forceps	Tools	55 INOX A.DUMONT&FILS	N/A	Very sharp fine tips for removal of chorion.
Fine waterproof sandpaper - p2000 grit size	Tools	Hermes Abrasives Ltd.	N/A	Very fine grit size for rolling/cleaning embryos with chorions.
3% methylcellulose	Reagent	Sigma	M 0512	High viscosity for holding embryos in place during transplantation.
1X BSS	Reagent	Made in-house	N/A	20XBSS: 130g NaCl, 8g KCl, 4g MgSO4.7H2O, 4g CaCl2.2H2O, and 10mg Phenol Red in 1L MilliQ water and autoclave; 500mM Hepes in MilliQ water autoclaved. Add 25ml 20XBSS and 15ml 500ml Hepes pH7.0, fill up to 500ml and filter sterilize before use.
Penicillin-streptomycin	Reagent	Gibco	15140-122	Added to BSS when incubating dechorionated embryos.
Pronase	Reagent	Calbiochem	53702	For dechorionation.
Hatching enzyme	Reagent	Made in-house	N/A	For dechorionation.
Tricaine mesilate (TMS)	Reagent	Sigma	A-5040	400mg tricaine in 97.9ml distilled water and 2.1ml 1M Tris, pH adjusted to 7; 4.2ml of this solution in 100ml clean tank water.
3% ultra-low gelling temp. agarose	Reagent	Sigma	A-2576	Type IX-A. Used during embedding of embryos for observation.
Petri dish culture chamber	Tool	Iwaki, Asahi Techno Glass Corp.	11-004-008	Iwaki glass base dish 35mm with 12mm window. Used during embedding of embryos for observation.
Micromanipulator	Equipment	Narishige	N/A	Model MN151. For removal and insertion of cells during transplantation.
Borosilicate glass capillaries	Tool	Harvard Apparatus	GC100-10T	For making transplantation needles.
Flaming/Brown micropipette puller	Equipment	Sutter Instrument Co.	Model P-97	For making transplantation needles.