Summary
定量DNA双链上的γH2AX灶的基础上休息，已经成为一个宝贵的工具，尤其是在放射生物学，组织的放射敏感性和辐射修改化合物的影响的评价。在这里，我们表现出的组织样本中γH2AX灶的定量免疫荧光法的使用。
Abstract
DNA双链断裂（DSB的），特别是致死和遗传毒性病变，可以产生内源性（生理或病理）的进程或外在因素，特别是电离辐射和radiomimetic化合物。磷酸化的组蛋白H2A的变种，H2AX的丝氨酸139残留，高度保守的C -末端SQEY图案，形成γH2AX，是一种早期反应的DNA双链断裂
Protocol
组织
- 肺组织，在模具中嵌入最佳切削温度（OCT）的化合物4583，切片（5μm）的使用CM徕卡1950年的低温恒温器，安装到聚- L -赖氨酸的幻灯片。
冷冻样品在默多克儿童研究所获得安博士劳斯莱斯。肺组织是未经处理的BALB / c小鼠的慢性呼吸道过敏性疾病，显示许多人类哮喘6的病理特征的小鼠模型。默多克儿童研究院坚持实践澳大利亚的关心和用于科研目的的实验动物的使用守则“动物伦理委员会提出的准则和法规的规定进行了动物实验。
- 部分被允许在室温空气干燥1小时。
免疫荧光染色
- 固定2％（W / V）多聚甲醛磷酸盐缓冲液（PBS）20分钟。
- 部分在PBS洗涤，每次15分钟的平衡。
- 部分均采用70％乙醇20分钟，由三个用PBS洗涤，每次10分钟（冷冻至-20 ° C）。
此时的幻灯片可在4 ° C储存在密封的容器内长达2个星期。
- 切片，用PBS洗三次，每次10分钟，然后用新鲜PBS中含有8％的PBS中含0.5％Tween - 20与0.1％的牛血清白蛋白准备100μL封锁的Triton X - 100在室温下1小时（PBS - TT） 。
所有孵化加湿染色槽。 - 第5分钟，用PBS - TT分别洗净，和疏水性的外围组织周围标有巴氏笔。
- 通风报信多余的缓冲液和主多克隆抗γH2AX抗体（稀释1％BSA的PBS 1:500;微孔）100μL，在室温下孵育2小时每节。
育才小学抗体可能会在一夜之间被执行4 ° C。
对于进一步的证据，即γH2AX灶代表双链断裂，主承认DSB修复蛋白的抗体也可使用。例如，γH2AX和磷酸化的ATM的合作，本地化是一个常用的组合。 - 节在PBS - TT洗两次，每次5分钟，并与二级抗体100μL（的Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG 1:500稀释，在1％BSA; Invitrogen公司）孵育1小时在室温下在黑暗中。 （稀释后的抗体，整个过程被蒙在鼓里）。
- 洗净切片，用PBS - TT三次，每次5分钟，并孵育0.5mg/ml的核糖核酸酶A为30分钟，在37 ° C。
- Vectashield介质中含有碘化丙啶核counterstaining和安装。
- 用指甲油密封的幻灯片，并储存于4 ° C黑暗环境中分析前通宵。
显微镜/分析
- 蔡司LSM510元共聚焦显微镜是用来获取图像，使用标准的绿色荧光蛋白（γH2AX - 的Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG）和PI（543 nm）的激光。
在Z系列模式图像获得一个0.5微米的一步大小。在分析过程中，个别飞机卷积和堆叠，以产生最大的投射影像，以减少灶重叠。
创建一个最大投射影像的前一个粒子计数的方法，只应在使用薄的部分（如5微米）和背景染色是微不足道的情况下使用。凡具有显着的背景较厚部分必须加以分析，如3D对象计数器Bolte和Cordelieres（2006）描述的更复杂的分析，应使用 7 。
- Metamorph分子器件，（美国）是用于创建合并（红色和绿色）图像定量灶的数字。
虽然Metamorph可用于定量灶数目，通常在使用组织病灶手动（眼），用于更精确的计算部分。
定量感兴趣的特定的细胞类型可以选择，例如肺上皮细胞。这可能是基于组织学和苏木和HE染色的连续切片。
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Discussion
这个演示中，我们使用未经处理的BALB / c小鼠，小鼠肺组织的慢性呼吸道过敏性疾病的小鼠模型的目的。我们定量细胞受损的肺相比，未经处理的部分的平均水平略高，每灶数量的差异。具体来说，定量表示6.5元/单元和9.4灶元/单元（每节20细胞人工计数）灶，在未经处理的组织和慢性呼吸道过敏性疾病组织的分别。然而，例如萘，这是众所周知的诱导小鼠肺癌模型的DSBs的DSB诱导剂的使用，会产生更高的疫源地号码。事实上，这个协议是最适合组织中的电离辐射的影响的调查;γH2AX灶数目和决议的条款，更惊人的结果，得到时使用电离辐射。这是众所周知的，下面的接触X射线，γH2AX灶的形式迅速和疫源地号码，最高达到30-60分钟之间 2 。因此，1小时的时间点（辐照后）评估初始DSB的形成和更长的时间（通常可达48小时），可用于监测DNA修复的理想选择。
总体而言，在组织γH2AX定量监测DSB的形成和修复。除了其在电离辐射的情况下的效用，该方法可以适用于DSB诱导各种组织中的化合物，例如常用的抗肿瘤药物蒽环类药物如阿霉素是已知的导致DNA双链断裂的疗效评价，并潜在地监测活性氧介导的DSBs特点的各种病症。重要的是，这个协议是适用于不同的鼠标组织。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
澳大利亚核科学与工程学院的支持，是公认的事实。 TCK的是AINSE奖项的收件人。表观医学实验室是支持由国家卫生和澳大利亚的医学研究理事会（566559）。 LM是由墨尔本研究所（墨尔本大学）和生物医学成像的华润补充奖学金支持。莫纳什显微成像（DRS斯蒂芬科迪ISKA卡迈克尔）的支持是这项工作的宝贵。蒙脱土是奥尔加Sedelnikova博士从美国国立卫生研究院的专家援助和意见表示感谢。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA. | |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound 4583 | Tissue-Tek | 4583 | ||
| Superfrost Plus | Polysine slides | Menzel-Glaser | SF41296SP | Electrostatically attracts frozen tissue sections and reduces the need for additional coatings and adhesives. |
| Tween 20 | Reagent | Calbiochem | 655205 | Tween 20 (0.5%), is a detergent to permeabilise cells |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells. |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Anti-phospho-γH2AX (rabbit polyclonal antibody) | Primary Antibody | Upstate, Millipore | 07-164 | Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen | A-11008 | Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Ethanol (70%) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | BSPEL316 | ||
| RNAse A | Reagent | Qiagen | 19101 | |
| Vectashield PI | Reagent | Vector Laboratories | H-1300 | A glycerol based mounting medium containing propidium iodide (a red nuclear stain).This medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index. Note: DNA stain commonly used: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Can only be used with microscopes with the appropriate excitation laser. |
| Mini PAP Pen | Invitrogen | 008877 | ||
| Coverslips (22x50mm) | Menzel-Glaser | CS2250100 | ||
| Coplin Jar, glass | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| Staining Trough | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal | Confocal Microscope | |||
| CM Leica 1950 Cryostat | Leica Microsystems | |||
| Metamorph | Software for Imaging analysis | Molecular Devices |
References
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Bonner, W. M.
- Dickey, J. S. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).
- Bhogal, N. Late residual gamma-H2AX foci in murine skin are dose responsive and predict radiosensitivity in vivo. Radiat Res. 173 (1), 1-9 (2010).
- Redon, C. E., Dickey, J. S., Bonner, W. M., Sedelnikova, O. A. gamma-H2AX as a biomarker of DNA damage induced by ionizing radiation in human peripheral blood lymphocytes and artificial skin. Adv Space Res. 43 (8), 1171-1178 (2009).
- Locke, N. R., Royce, S. G., Wainewright, J. S., Samuel, C. S., Tang, M. L., L, M. Comparison of airway remodeling in acute, subacute, and chronic models of allergic airways disease. Am J Respir Cell Mol Biol. 36 (5), 625-632 (2007).
- Bolte, S. &, Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
