Summary
유전 공학 또는 큰 샘플 크기를 요구하지 않고, 고유의 단백질 - 단백질 상호 작용의 구분, 강력하고, 생화학 평가를 허용하는 IP - FCM 방식은 제공됩니다.
Abstract
유동세포계측법 (IP - FCM)에 의해 감지 Immunoprecipitation은 단백질 - 단백질 상호 작용을 감지하고 quantifying위한 효율적인 방법입니다. 기본 원리는 촬영한 기본 analyte가 실제로 multiprotein의 단지 내에 관련된 다른 분자와 함께 감지할 수했었습니다 샌드위치 엘리사의 그것을 확장합니다. 절차는 관심의 단백질에 대한 단클론 항체 (mAb) 특정을 immunoprecipitating 세포 lysates 이러한 구슬을 잠복기, fluorochrome - 복합 프로브와 함께 캡처 단백질 단지를 프로빙 및 유동세포계측법의 구슬 - 관련 형광을 분석과 폴리스티렌 라텍스 microbeads의 공유 결합 결합을 포함한다. IP - FCM은 매우 민감한 것입니다 자신의 모국어 (비 변성) 상태에서 단백질의 분석이 가능하고, 중 반 정량 또는 정량 분석 의무가 있습니다. 추가 장점으로 IP - FCM은 흐름 cytometer 이외의 유전 공학이나 전문 장비를 필요로하지 않으며 그것은 쉽게 높은 처리량 어플 리케이션에 적용할 수 있습니다.
Protocol
원시 단백질 - 단백질 상호 작용 및 유동세포계측법에 의해 multiprotein의 단지의 높은 감도 감지 및 정량 분석 : **이 비디오 프로토콜은 관련 출판 일을 기반으로합니다. 아담 G. Schrum, 다이애나 길, 일레인 P. Dopfer, 데이비드 L. 위스트, 로렌스 A. Turka, 볼프강 WA Schamel, 에드 파머. 과학의 STKE 2007 (389) : pl2 6 월 5, 2007, [간접 : 10.1126/stke.3892007pl2]. 본 자료를 보시려면 여기를 클릭하십시오 .
시작하기 전에 다음 수성 주식 솔루션 준비 :
| MES 커플링 버퍼 : | 25 스토어 ° C |
| MES, 산도 6.0 | 50 MM |
| EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) | 1 ㎜ |
| 칭 / / 스토리지 (QBS) 버퍼를 차단 : | 4 스토어 ° C |
| BSA | 1퍼센트 |
| 나트륨 azide | 0.02 % |
| PBS, 산도 7.4 | 1X |
| FCM 버퍼 : | 4 스토어 ° C |
| 트리스, 산도 7.4 | 50 MM |
| NaCl | 100 MM |
| 나트륨 azide | 0.02 % |
| FBS | 5% |
| PBS, 산도 7.4 | 1X |
사용하기 전에 바로 준비 :
| EDAC - MES : | MES 커플링 버퍼 50 MG / ML의 EDAC 분말을 디졸브 |
| Digitonin 솔루션 (2 % W / V) : | 95 가열하여 DH 2 O에서 digitonin 가루를 해산 ° C 5 분에 대한 다음 얼음에 냉각 |
| 용해 완충액 : | |
| 트리스, 산도 7.4 | 50 MM |
| NaCl | 150 음 |
| Digitonin 솔루션 | 1퍼센트 |
| 프로 테아제 억제제 | 1X |
| 얼음 계속 |
1. 비즈로 mAb의 커플링
- PBS에 diluting와 hemacytometer로 계산하여 구입한 주식의 구슬의 농도를 결정합니다. 계산을위한 구슬의 1:10000 희석과 함께 시작합니다.
- 피펫 18 1.5 - ML의 microcentrifuge 관으로 X 10 6 구슬.
- 각 세척 후 25 3 분 2만그램 ° C에서 centrifuging, 0.5-1.0 ML MES 커플링 버퍼에있는 비즈에게 2-3 번 씻으십시오.
- 50 μL MES 커플링 버퍼에있는 구슬을 Resuspend.
- 신선한 EDAC - MES 20 μL를 추가하여 비즈의 카르 복실 그룹을 활성화합니다.
- 25 ° C 수동으로 최대 pipetting 아래로 약 15 분 가볍게 섞는다.
- 25 3 분 20,000그램에 centrifuging ° C를 각 씻고 나서, 0.5-1.0 ML PBS의 활성화 비즈에게 2-3 번 씻으십시오.
- 50 μL PBS에서 활성 비즈를 Resuspend.
- 활성 비드 솔루션 IP mAb (0.2-1.0 MG / ML 재고 농도에서) 50 μL를 추가합니다.
- 진동 흔드는에 튜브를 삽입하여 25 ° C에서 3-4시간위한 섞는다. 튜브의 바닥에있는 구슬을 정착 방지하기 위해 충분히 흔들어.
- 와시 mAb - 결합 구슬은 0.5-1.0 ML PBS 2 3 회, 각 씻어 후 25 3 분 2만그램에서 ° C centrifuging.
- 100 μL QBS 버퍼에있는 구슬을 Resuspend. 이러한 4 ° C.에 저장할 수 있습니다
- 구슬을 중단하는 것은 물론, PBS에서 1:200-1:10,000을 희석하고 hemacytometer로 계산됩니다. 농도는 각 IP 또는 풀다운 실험에 사용되는 구슬의 개수를 정확하게 제어할 수 있도록, 각 예비 배치에 대한 측정해야합니다.
2. 포스트 핵 Lysate 준비와 IP
용해 방법 및 최적 용해 조건의 셀 유형과 검사되는 단백질 단백질 상호 작용에 따라 달라집니다. 프로토콜 번호가 존재하고 응용 프로그램을 수정할 수 있습니다.
- 이러한 lymphocytes, 또는 5 20 X 10 6 '작은'세포를 Lyse X 10 등 macrophages 또는 종양 세포와 같은 6 '대형'세포, 얼음에 20 분에 대해 1.5 ML microcentrifuge 관 100 μL 신선한 용해 버퍼 인치 필요에 따라 용해 볼륨을 스케일.
- 핵 및 불용성 세포 파편을 제거하려면, 4 10 분 ° C.에 대한 2만g에서 lysate를 원심 분리기 뜨는 유지하고 펠렛을 삭제.
- 섞어 부드럽게 pipetting 0.5 X 10 명확히 lysate로 5-2.5 X 10 5 mAb 결합 구슬을 추가합니다. 우리가 사용하는 최소 볼륨단일 IP를 수행 5 μL입니다.
- 추운 방에서 하룻밤에 수직 회전 바퀴 4시간에 놓습니다. 정착의 구슬을 방지하기 위해 충분한 속도로 설정하십시오. 그것은 회전하는 동안 튜브의 바닥에 남아 낮은 볼륨의 IP를 액체에 대한 허용됩니다.
3. Fluorochrome - 복합 항체와 비드 - 캡처 단백질의 탐색
- 4 2만그램에서 centrifuging ° C를 각 씻어 후 3 분, 0.2-1.0 ML 얼음처럼 차가운 FCM 버퍼의 IP 비즈 두 번 씻으십시오.
- 굴뚝 - 바닥 접시 5 개 이상의 1.5 ML microcentrifuge 튜브 또는 우물의 각에 100 μL FCM 버퍼와 나누어지는 20 μL의 구슬을 Resuspend.
- 샘플로 fluorochrome - 복합 mAbs를 추가합니다. FCM은 공급 업체의 지시에 따라 또는 경험적으로 결정 농도에 따라 얼룩 수행합니다. 출발점으로, 튜브 당 또는 잘 주식 항체 솔루션의 0.2-1 μL를 (0.2-1.0 MG / ML에서) 추가하고 얼음에서 40 분 품어.
- 세차 4 2만그램에서 centrifuging, 1.0 ML 얼음처럼 차가운 FCM 버퍼의 1.5 ML 튜브에 두 번 구슬을 탐색할 · 각 세척 후 3 분 C. 부드럽게 구슬을 방해하지 않도록 돌봐 각 세척 후 표면에 뜨는를 제거합니다. 굴뚝 - 바닥 접시, 4에서 5 분 1,000그램에 centrifuging, 0.2 ML 얼음처럼 차가운 FCM 버퍼로 두 번 씻어 ° C를 각각 씻고 나서. 멀티채널 pipettor이 단계에 유용합니다. 굴뚝 - 바닥 플레이트의 비즈에서 뜨는 제거하려면, '영화'는 접시 한 다음, 계속 거꾸로 반면, 우물의 가장자리로부터 drips을 얼룩. 각 우물에 잔류 볼륨은 구슬을 포함, 약 20 μL 것입니다.
- 샘플 당 200 μL FCM 버퍼에있는 구슬을 Resuspend. 표시 외과 튜브로 전송. 샘플 지금 FCM에 대한 준비가되어 있습니다.
4. FCM 취득
이 프로토콜에 설명되어있는 CML 비즈는 직경 3-5 μm의, 정지 마우스 림프구의 약 절반 직경입니다. 따라서 수동으로 규모 등록 비드 이벤트의 인구에 대한 순서로 전달 스캐터 (FSC) A 이득과 사이드 스캐터 (SSC) 전압을 증가시킬 필요가있을 수도 있습니다. 개인 IP 구슬은 단일 단단히 클러스터된 인구를 형성한다. 설정 및 문은 구슬 doublets와 찌꺼기를 제외 조정해야합니다.
- 이전 실행 구슬 또는 구슬 기준을 일부 cytometers에 샘플 입구 주변 비말 억제 슬리브를 제거합니다. 이 입구의 선택을 취소 한 샘플에서 다른 이월되는 구슬을 방지하므로, 칼집 유체는 샘플 사이에 똑 수 있습니다.
- 부정과 긍정적인 형광 극단 모두 로그 스케일 X - 축에 동시에 나타나도록 설정을 조정 레이블이 지정되지 않은 구슬, 형광의 부정적인 제어 및 레인보우 보정 입자 (RCPs), 형광의 긍정적인 컨트롤을 사용합니다. 이것은 실험 샘플의 형광도 규모에 될 수 있도록합니다. 그래서 FSC와 SSC 매개 변수뿐만 아니라, 게이트 위치가 일시적으로 해당 샘플에 대한 변경해야 할 수도, RCPs은 CML 비즈보다 작은됩니다.
- RCPs과 교정이 완료되면 레이블이 지정되지 않은 - 구슬 설정으로 돌아갑니다. 샘플마다 하나의 형광 프로브를 사용하는 경우에는 형광 보정이 필요하지 않습니다. 일반적으로, 우리는 FCM 샘플마다 하나의 fluorochrome - 복합 mAb와 multiprotein의 단지를 탐사하고, 우리는 다양한 subunits 특정 mAbs과 병행하여 비드 샘플을 얼룩하여 여러 상호 작용 파트너를 확인합니다.
- 형광 데이터 파일을 수집하고 저장합니다. 분석은 다음 유동세포계측법와 같은 CellQuest, FlowJo으로 소프트웨어 또는 CFlow를 사용하여 수행할 수 있습니다.
5. 대표 결과
그림 1. 마우스 변형에서 TCR/CD3 multiprotein 복합을위한 IP - FCM. T 세포는 BALB / C는 1 % digitonin에 lysed 있었고, lysate는 안티 - CD3ε 비즈를 사용하여 IP - FCM를 받게되었다. 캡쳐 단지는 TCR - β의 상당 수량 (보라색 지역)을 포함하고 공동 관련된 인 경우에는 3 번 CD - ε (녹색)하지만, 가까운 같은 Thy1.2 같은 다른 단백질의 배경 수준 (없는 면역 글로불린 프로브, 핑크 추적에 의해 정의)에, CD45, 또는 H - 2K (D) (갈색, 오렌지, 파랑 흔적, 각각). 비슷한 방식으로 이전에 게시된 결과 1-6을 참조하십시오.
Discussion
단백질 - 단백질 상호 작용에 대한 정보는 신호 전달, 가계의 성숙, 세포주기 진행 및 apoptosis의 폭포 많은 세포 프로세스의 분석 관련성이있다. IP - FCM은 단백질의 상호 작용을 검토하고 원시 형태의 multiprotein의 단지의 멤버를 정의하기 위해, 빠른 양적 및 민감한 방법을 제공합니다. 비즈는 결합 및 세포 lysates incubated로 하루에와 탐지하고 그 다음날 분석할 수 있습니다. 96 - 웰 플레이트 형식은 통계 또는 검사 목적을 위해 효율적인 데이터 수집을 제공하기 위해 한 번에 분석하기 위해 샘플을 다수의 허용합니다. 형광 비드 표준을 사용하여 각 비드 점령 단백질의 수를 추정 수 있습니다. 거의 원본 자료는 캡처 및 탐지에 필요한이므로 제한된 샘플 및 부족 analytes은 여전히 여러 상호 작용에 대한 분석을하실 수 있습니다. IP - FCM이 아닌 생리적 환경에서 단백질의 혼합 유전 공학, 에피토프 - 태그, 변성, 또는 - 체외 필요하지 않지만, 그것은 그것에 적용과 가치 및 접근 도구를 만들고, 이들과 다른 기술을 결합 수 있습니다 많은 생물 학적 시스템.
문제 해결 :
대부분의 IP - FCM 실험에 유용 단백질 상호 작용 데이터에게 그들이 시도하는 처음 생성합니다. 그러나, IP - FCM의 최적화 구슬, 단백질 복잡한 캡처 및 바인딩 형광 프로브에 항체 활용을 향상시킬 수 있습니다.
IP 항체 활용의 효율을 방지 면역 글로불린 항체와 직접 결합 구슬을 탐색하여 결정하실 수 있습니다. 이 효율이 낮은 경우, 커플링 반응 중에 항체의 농도를 증가하는 것은 많은 IP 항체가 각각의 구슬에 첨부할 수 있습니다. 이것은 analytes의 향상된 캡처 및 검색의 결과로, IP 비드 배치의 바인딩 용량을 늘릴 수 있습니다. 이러한 낮은 mAb 커플링의 비드 부착 및 결과에 대한 mAb와 경쟁할 수와 같은 다른 기본 - 아민 포함하는 분자 (예 : 트리스, 소 혈청 알부민), 커플링 반응 동안에 존재해서는 안됩니다. 구슬로 mAb의 활용이 다른 이유로 문제가 증명하는 경우, 구슬 대신 아비딘 / streptavidin을 결합 수 있으며, biotinylated 항체는 이후 비 covalently 바운드 및 immunprecipitation 사용할 수 있습니다.
좋은 항체 활용에도 불구하고, 비드 - 관련 형광의 초기 감지는 낮은 수 있습니다. 첫째, 복잡한 촬영 자체가 적을 수 있습니다. IP - FCM은 단위 용해 량 당 lysed 세포의 수를 증가 analytes의 농도에 의존하기 때문에 analyte 캡처 및 감지를 높일 수 있습니다. 또한 캡처는 캡처 이하의 구슬에 걸쳐 단지, 그리고 탐지 비드 당 평균 형광 증가의 결과를 배포 lysate와 함께 incubated IP 구슬의 개수를 줄임으로써 향상된 수 있습니다. 둘째, 그것은 캡처한 단지에 프로브 항체의 액세스가 sterically immunoprecipitating 항체에 의해 방해되어 있습니다. 이 경우에는 문제가 및 / 또는 탐침을 캡처하는 다른 항체를 사용하여 해결할 수 있습니다.
Acknowledgments
이 작품은 이글스 혁신 수상 (이글스의 성 오더)와 메이요 재단에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| carboxylate-modified polystyrene latex (CML) beads (5mm surfactant-free) | Reagent | Interfacial Dynamics | 2-5000 | Store at 4°C. |
| Rainbow Calibration Particles | Reagent | Spherotech, Inc. | RCP-30-5A | Store at 4°C. |
| 2-[N-Morpholino] ethanesulfonic acid (MES) | Reagent | Sigma-Aldrich | M-5287 | |
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropl) carbodiimide HCl (EDAC) | Reagent | Sigma-Aldrich | 22980 E-6383 | Store at -20°C under desiccating conditions. |
| Protease Inhibitor General Use Cocktail, containing AEBSF, Bestatin, Aprotinin, EDTA, E-64, and Leupeptin | Reagent | Sigma-Aldrich | P-2714 | Prepare 100x stock solution in H2O. Aliquot and store at -20°C. Handle with gloves. |
| PCR plates, 96-well 0.2mL, natural, tall chimney | Reagent | Fisher Scientific | 08-408-230 | For use in place of microcentrifuge tubes during FCM staining |
References
- Schrum, A. G. High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry. Sci STKE. , pl2-pl2 (2007).
- Schrum, A. G. Visualization of multiprotein complexes by flow cytometry. Curr Protoc Immunol. Chapter 5, 9-9 (2009).
- Teixeiro, E. T cell division and death are segregated by mutation of TCRbeta chain constant domains. Immunity. 21, 515-526 (2004).
- Teixeiro, E. Different T Cell receptor signals determine CD8+ memory versus effector development. Science. 323, 502-505 (2009).
- Treves, S. Junctate is a key element in calcium entry induced by activation of InsP3 receptors and/or calcium store depletion. J Cell Biol. 166, 537-548 (2004).
- Gil, D., Schrum, A. G., Alarcon, B., Palmer, E. T cell receptor engagement by peptide-MHC ligands induces a conformational change in the CD3 complex of thymocytes. J Exp Med. 201, 517-522 (2005).
