Summary
Dans ce papier nous présentons une méthode de transplantation de cellules souches humaines dans les différentes régions du système nerveux central de l'embryon de poulet. Ceci fournit une
Abstract
L'embryon de poulet est un modèle animal classique pour étudier le développement normal de l'embryon et du fœtus et pour des expériences de xénotransplantation d'étudier le comportement des cellules dans un standardisés
Protocol
1. Isolement et culture des cellules souches humaines et la préparation pour injection dans des embryons
- Les cellules souches humaines utilisées comme exemples dans ce protocole (cerveau, tissu adipeux de la moelle osseuse), sont isolés de différentes façons à partir des tissus différents. Par exemple, cellules souches neurales adultes sont isolées à partir de morceaux de tissus prélevés sur la paroi ventriculaire du cerveau pendant la neurochirurgie endoscopique, qui sont ensuite dissociés des cellules individuelles qui sont cultivées in vitro. Les cellules souches neurales forment spontanément des neurosphères qui flottent dans le milieu de culture tout autres types de cellules adhèrent au fond du plat 7. Adipeuses cellules souches mésenchymateuses sont obtenus à partir de matériaux liposuccion qui est une digestion enzymatique et tendues pour enlever le tissu fibreux et ensuite centrifugé pour éliminer les adipocytes matures. Les cellules obtenues sont remises en suspension dans un milieu de culture supplémenté avec du sérum pour promouvoir la prolifération des cellules souches sur d'autres types cellulaires 8 souches hématopoïétiques et les cellules progénitrices peuvent être isolés à partir des aspirations de moelle osseuse par sélection positive en utilisant des anticorps spécifiques conjugués à des particules magnétiques (Myltenyi Biotec, Allemagne ou de Dynal-Invitrogen, USA) et la séparation magnétique de cellules, et / ou en utilisant des anticorps conjugués à des fluorophores et la fluorescence de tri cellulaire (FACS) 9.
- Afin de faciliter une identification ultérieure, l'étiquette des cellules souches avec un marqueur fluorescent avant l'implantation dans des embryons de poulet. Les cellules souches peuvent être étiquetés avec les colorants lipophiles fluorescents tels que DII (Invitrogen, USA) ou PKH26 (Sigma, USA) en utilisant le fournisseur recommandé par les protocoles jusqu'à peu de temps avant l'implantation, ou, pour une étiquette permanente avec essentiellement aucun danger de contamination des cellules hôtes, ils peuvent être transduits avec le gène codant pour une protéine fluorescente comme la Green Fluorescent Protein, en utilisant des vecteurs lentiviraux, tout en restant dans la culture 10.
- Protocoles pour la culture et la propagation des cellules souches humaines varient. Des protocoles détaillés peuvent être trouvés dans la littérature. Brièvement, les cellules souches sphère formant sont généralement cultivés dans des flacons, alors que les cellules souches adhérentes sont généralement cultivées dans des boîtes de Pétri (qui facilitent la trituration lors du partage, voir ci-dessous), en milieu approprié. Pour le fractionnement ou la récolte, granulés sphère formant des cellules par centrifugation 5 min à 1200rpm et remettre en suspension dans préchauffé trypsine / EDTA solution pour pas plus de 5 minutes à 37 degrés Celsius. Pour ajouter des cellules adhérentes de la solution de trypsine / EDTA à la boîte de Pétri, puis triturer au bout de 5 minutes. Terminer la trypsination en ajoutant Ca 2 + milieu contenant, parfois complétée par de l'albumine. Pour enlever la trypsine / EDTA, centrifuger les cellules (5 min à 1200rpm), éliminer le surnageant, remettre en suspension dans des véhicules d'injection à froid (généralement à moyen ou un tampon phosphate salin), et centrifuger à nouveau (5 min à 1200rpm). Enlever la plupart de ce surnageant et remettre les cellules en douceur pour créer une suspension de cellules hautement concentré.
- Gardez la suspension de cellules souches humaines dans un petit flacon bouché ou tube de micro sur la glace pendant plusieurs heures avant l'injection. La survie dans cet état peut être de type cellule-dépendant. Le véhicule d'injection doit être optimisé en fonction des propriétés des cellules, y compris leur adhésivité (par exemple un véhicule à basse Ca 2 + peut aider à prévenir l'agglutination) et la résistance aux changements de l'hypoxie et le pH.
2. Incubation des oeufs et de la préparation
- Boutique oeufs fécondés dans une chambre de refroidissement (par exemple: Termaks, Bergen, Norvège) à 14-15 ° C avant l'incubation. A cette évolution de la température est arrêté jusqu'au début de l'incubation. Les oeufs fécondés stockés pendant plus de 10 jours ou à basse température ont un taux inférieur de développement ultérieur et la survie.
- Pour relancer le développement, placer les oeufs dans un incubateur humidifié, forcé incubateur projet (par exemple: Binder, New York, USA) à 38-39 ° C, et incuber jusqu'au stade de développement souhaité est atteint (pour la stadification, voir réf 11. ).
- Avant l'ouverture de l'œuf, créer une poche d'air au-dessus de l'embryon en insérant une aiguille 18 gauge seringue à travers la coquille d'oeuf (pas trop profondément pour éviter de percer le jaune) et d'évacuer 4 ml d'albumine (figure A). Cela crée une chute de pression qui en quelques minutes est égalisé par l'entrée d'air à travers la coquille poreuse. Comme l'air pénètre qu'elle recueille au plus haut point dans la coquille, séparant ainsi l'embryon de la surface interne de la coquille.
- Sceller le trou créé par l'aiguille de la seringue avec du ruban de plastique conventionnels.
3. Tirer micropipettes de verre
- Tirez micropipettes de verre de borosilicate (par exemple, 1,2 mm x 0,94 OD mm ID, Harvard Apparatus, USA) sur un extracteur électrode classique (par exemple, le modèle P-2000, Sutter Instruments, USA). Réglez les paramètres extracteur d'obtenir micropipettes qui ont une résistance d'entrée élevée lorsqu'il est utilisé comme microelectrodes. Conseils devrait être d'environ 1-1,5 cm de long. Les arbres peuvent être marqués à intervalles de 1 mm pour le calcul des volumes éjectés.
- Cassez les conseils micropipette à une dimension raisonnable en les pliant avec un forceps ou les poussant contre une surface solide tout en regardant sous un microscope. La rupture doit être aussi uniforme que possible autour du périmètre de la vitre et le diamètre intérieur résultante à la pointe doit s'adapter à la taille des cellules pour être utilisé sans se bouche. Typiquement un diamètre de 20 à 30 microns intérieur fonctionne bien.
4. Préparation de la solution de colorant vert rapide (réactif contrastées)
- Préparer une solution à 0,1% (p / v) de Fast Green colorant (Sigma-Aldrich, USA) en dissolvant dans une solution saline physiologique de poulet (137 mM NaCl, 5 mM de KCl, 2 mM de CaCl2, MgCl2 1 mM, 1 mM de Na- phosphate, 5 mM HEPES, 11 mM de glucose, pH 7,4).
- Filtrer la solution Fast Green à travers un filtre de 0,22 um Millex GP (Millipore Co., Bedford, USA).
5. Ouverture des œufs et contrastées de l'embryon
- Placez deux morceaux de ruban adhésif sur le dessus de l'oeuf, couvrant les dimensions de la poche d'air. Garder les oeufs orienté de sorte que la zone enregistrée (et donc la poche d'air) est la plus élevée, couper une petite fenêtre à l'intérieur de la zone de scellés à l'aide des ciseaux de dissection robuste. Le ruban ajoute le support et aide à prévenir des fragments de coquilles de tomber sur l'embryon. Les bulles d'air associé à la poche d'air peut être sauté en utilisant l'extrémité arrière d'une pipette en plastique ou autres sonde mousse.
- Dessinez une solution Fast Green dans une seringue de 1 ml avec une aiguille de calibre 25. Retirer les bulles d'air dans la seringue et l'aiguille. Plier l'aiguille à un angle de 45 degrés, pénètrent à un point hors de la plaque embryonnaire (identifié par l'anneau de vaisseaux sanguins qui la circonscrire; percer dans la plaque augmente la mortalité embryonnaire) et soigneusement guider l'aiguille dans l'embryon. Injectez le colorant jusqu'à ce contraste désiré est atteint. L'embryon, qui est normalement transparent, devrait maintenant se démarquer comme un fantôme blanchâtre sur la couleur vert foncé (figure B). De nombreux chercheurs utilisent l'encre de Chine (dilué à 10% v / v) au lieu de vert rapide. Dans ce cas, il est important d'utiliser l'encre de Chine qui est non-toxique, tels que l'Inde Fount Pelikan Encre.
6. Faire cerveau postérieur et lésions de la moelle épinière du tube neural
- Produire des aiguilles de tungstène aiguisée par la flamme-gravure courte (2-3 cm) de 100 um de diamètre tige de tungstène (719000, numéro de catalogue A & R Systems, Seattle, Washington), avec une torche à acétylène / oxygène. Cela se fait en insérant l'extrémité de la tige très brièvement dans la flamme du chalumeau jusqu'à ce qu'une étincelle est vu, ce qui représente l'érosion explosive des couches extérieures de tungstène, laissant derrière lui une pointe acérée.
- En utilisant une aiguille aiguisée de tungstène, fendre et dévier la membrane vitelline couvrant la zone pour la microchirurgie.
- En utilisant une aiguille de tungstène seconde aiguisé (le bout de la première aiguille est souvent endommagée après tranchage à travers la membrane vitelline et impropres à la microchirurgie ultérieures), couper soigneusement à travers l'épithélium recouvrant le tube neural et le dévier, puis coupez autour et sous la pièce du tube neural à être retiré, en utilisant courts, rapides coups vers le haut (Figure C). Faire des coupes transversales d'abord, puis les coupes longitudinales est généralement le plus de succès. Ne pas couper trop profondément ou vous risquez de pénétrer les vaisseaux sanguins sous-jacents, qui est généralement mortelle.
- Doucement flip ou faites glisser le morceau de tissu réséqué loin du site de la lésion en utilisant l'aiguille de tungstène. Si cela s'avère difficile, il peut également être retiré par aspiration la bouche à l'aide d'une micropipette de verre attaché au tuyau flexible.
7. L'injection de cellules souches humaines
a. L'injection dans une lésion du tube neural
Dessinez une petite quantité de cellules dans la pointe d'une micropipette de verre par aspiration la bouche en utilisant un tube en plastique. La concentration de travail de la suspension cellulaire doit être optimisé pour le type de cellules à injecter. Montez la micropipette sur un micromanipulateur et le connecter à une pompe microinjecteur (par exemple: PV830 PicoPump pneumatique, WPI, Washington, USA). Sous contrôle visuel à l'aide d'un microscope de dissection, guide la pointe micropipette dans la lésion et soigneusement expulser les cellules en augmentant la pression d'air (soit par des impulsions de pression constante ou en montée en puissance progressive de la pression) (Figure C). Lorsque la quantité désirée de cellules est déposé dans le site de la lésion, soigneusement retirer la micropipette.
b. L'injection dans le lumen du tube neural
Dans certains cas il peut être souhaitable d'injecter des cellules dans les ventricules du cerveau en développement, par exemple si les cellules sont envahissantes suffisant pour accéder au tissu neuronal en l'absence de lésions. L'injection de cellules dans la lumière de tout brAin région exige l'aide d'un stade de développement au cours de laquelle la lumière fournit un récipient assez grand et est facilement accessible; stades HH 12 à 18 sont favorables à cet égard. Une lésion n'est pas nécessaire. Il suffit de percer la paroi du tube neural à la micropipette de verre avant l'injection des cellules. Les éléments clés de la réussite de cette méthode sont la netteté de la micropipette et la soudaineté de la pénétration; trop lent mouvement et la pointe micropipette ne peut fossette la paroi du tube neural sans pénétrer.
C. Injection systémique
Injections systémiques peuvent être effectuées via les vaisseaux sanguins extra-embryonnaires (à partir de l'étape HH 15, lorsque ces navires sont bien développés). Ce n'est pas rare accompagné de quelques saignements et depuis il ya beaucoup de petites artères et des veines moins grandes, injections intra-artérielles sont généralement plus sûrs quand il s'agit de la survie de l'embryon. D'autre part, des injections intraveineuses de fournir un accès plus rapide des cellules du cœur et donc probablement une distribution plus égale des cellules. Une injection réussie nécessite une micropipette forte avec un diamètre plus petit que le navire cible. Approche du navire long de son axe à un petit angle avec l'horizontale (environ 30 degrés). Poussez la micropipette contre le navire jusqu'à ce que le bateau commence à obstruer. Puis pousser plus loin dans une entreprise, mouvement brusque de pénétrer. Rentrez lentement jusqu'à ce que le sang est considérée comme nulle par capillarité dans la pointe de la micropipette. L'injection de cellules doit alors être effectuée en utilisant une pression constante, après quoi la micropipette est rentré avec un mouvement rapide.
8. Etanchéité de l'oeuf
- Après l'injection, laissez l'oeuf rester immobile pendant quelques minutes pour permettre aux cellules injectées à s'établir et à se conformer. Pour éviter la déshydratation (qui peut se produire rapidement et peut s'avérer mortelle), poser un morceau de tissu imbibé ou papier filtre sur la fenêtre pendant cette période de repos.
- Après quelques minutes, et les cellules se sont installés, sèche la coquille autour de la fenêtre et sceller la fenêtre avec du ruban de plastique conventionnels. Assurez-vous que ce joint est serré et que personne ne peut fuir l'albumine par l'ouverture ou entre la coquille et le ruban (ce qui prouve souvent mortelle pendant l'incubation subséquente).
- Remplacer les oeufs dans l'incubateur à air pulsé pour le développement ultérieur. L'observation peut être faite à intervalles en enlevant le ruban adhésif sur la fenêtre.
9. La dissection des embryons
- Une fois que l'embryon a atteint le stade désiré, crack ouvrir l'œuf dans un bol de glace froide sérum physiologique ou de tampon phosphate salin (la bande couvrant la fenêtre devrait être la première coupe de permettre aux deux moitiés de la coquille de se séparer). La solution saline glacée sert à anesthésier l'embryon par l'hypothermie. Le cœur devrait rapidement ralentir et s'arrêter au bout de quelques minutes.
- Séparez les embryons à partir des membranes extra-embryonnaires et le mettre en scène en utilisant la réf. 11.
- Décapiter l'embryon, le transférer à un plat de dissection qui a un sol en caoutchouc de silicone et contient du sérum physiologique oxygénée supplémenté en glucose (137 mM NaCl, 5 mM de KCl, 2 mM de CaCl2, MgCl2 1 mM, 1 mM de Na-phosphate, 5 mM HEPES, 11 mM de glucose, pH 7,4) et la broche qu'elle côté rapide ventrale en place. Retirer les viscères abdominaux et thoraciques. En utilisant une paire de ciseaux à angle, faire des incisions longitudinales le long de chaque aspect de ventrolatérale de la colonne vertébrale. Particulièrement à des stades plus tard (après 6 jours de développement), l'incision initiale est mieux faite dans la région lombo-sacrée, où l'espace entre les vertèbres et la moelle épinière est la plus forte. Retirez la face ventrale de la colonne vertébrale de révéler la moelle épinière. Assurez-vous que le sérum physiologique reste oxygénée par barbotage à environ 10 minutes d'intervalle avec de l'oxygène médical pur.
- Découpez soigneusement les racines naissantes dorsale et ventrale de chaque côté, transect de la moelle épinière au niveau désiré, et puis le soulever doucement du canal vertébral. La moelle épinière va survivre pendant plusieurs heures dans cet état et peut être soumis à 12 anatomiques et physiologiques 13,14 expériences.
Figure 1. A) L'approche appropriée pour l'évacuation de l'albumine. Notez la position de l'embryon et le placement de l'aiguille. B) contrastées de l'embryon. Notez le point de pénétration de l'aiguille en dehors du disque embryonnaire. C) Représentation schématique de la procédure à suivre pour une lésion unilatérale du tube neural épinière suivie par une transplantation de cellules.
Discussion
L'embryon de poulet est un modèle animal pratique et polyvalent pour des expériences de xénotransplantation. L'absence d'un système immunitaire fonctionnel pendant le développement embryonnaire et foetal permet la survie et le développement de cellules provenant d'une espèce qui tolère la température d'incubation. Embryons de poulet ont été utilisés pour tester le potentiel de régénération de divers types de cellules souches (examiné dans la réf. 15). Cellules souches chez les mammifères peuvent intégrer dans les tissus d'embryons de poulet, y compris le système nerveux central, où ils peuvent donner lieu à des projections axonales des neurones dont la connectivité synaptique et les propriétés électrophysiologiques peuvent être évalués dans le contexte de 1,2 fonctionnelle des circuits neuronaux.
Parce que les procédures chirurgicales sont relativement faciles, et les injections sont faites en vertu visuelle au lieu de contrôle stéréotaxique, le nombre d'embryons peuvent facilement être augmentée pour s'adapter à différentes conditions expérimentales au sein d'une seule expérience. Généralement les cellules peuvent être injectées dans des embryons de 20 à 30 au sein d'une expérience de 4 heures. La mortalité post-injection de l'embryon est le principal facteur limitant. Des précautions doivent être prises pour éviter une hémorragie et de déshydratation. Soyez conscient qu'il ya certaines étapes critiques du développement à laquelle le taux de mortalité naturelle augmente. Complétant l'embryon avec quelques ml d'eau tiède, l'injection de poulet sonnerie stérilisé suivant et le jour avant les stades critiques du développement, ainsi que d'assurer que la fenêtre dans l'œuf est bien scellé et orientée pour éviter les fuites, améliore la survie. Si une fuite à travers le joint de bande doit se produire, retirez le ruban adhésif, les surfaces sèches et re-bande. Certains chercheurs utilisent de la cire et le verre ou en plastique des lamelles pour sceller la fenêtre. La mortalité ne devrait pas être substantiellement différentes de injectés par rapport opérés de manière fictive embryons.
Bien que nous nous sommes concentrés ici sur l'injection de cellules souches humaines dans l'ébauche du cerveau et la moelle épinière, les cellules souches peuvent également être injecté dans l'ébauche d'autres organes (voir réf exemple. 4). Chaque organe pose ses propres défis. Par exemple, l'injection dans le coeur peut être difficile en raison de la résistance mécanique élevée à la pipette la pénétration et à cause de mouvements, qui d'autre part peut être ralentie par le refroidissement des embryons à la température ambiante avant l'injection. Les organes qui n'ont pas de lumière ne peut pas accueillir l'injection de volumes suffisants et peut donc nécessiter une lésion chirurgicale afin de créer un réceptacle. Dans notre expérience, la régénération des tissus après une lésion est un avantage car elle favorise l'intégration des cellules souches humaines dans le tissu. Les cellules peuvent également être injecté dans le mésenchyme embryonnaire comme le mésenchyme somitique dispersion ou de la crête neurale migrent en tant que moyen de parvenir à l'incorporation dans les produits dérivés mésenchymateux, y compris les dérivés de la crête neurale ganglions périphériques 16,17.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Le travail a été soutenu par des subventions de Helse og rehabilitering (JLB), le Norvégien Research Council (GH et JCG) et l'Université d'Oslo (NK et JCG).
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescent microscope | Microscope | Olympus Corporation | ||
| Stereo Investigator | Program | MBF Bioscience | ||
| MIP-GFP mice | Mice | Jackson Laboratory | ||
| Mathematica | Program | Wolfram | ||
| Image J | Program | National Institutes of Health | ||
| Slidebook | Program | Olympus Corporation |
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