Summary
En este trabajo se presenta un método para el trasplante de células madre humanas en varias regiones del sistema nervioso central del embrión de pollo. Esto proporciona una
Abstract
El embrión de pollo es un modelo animal clásico para estudiar el desarrollo embrionario y fetal normal, y para los experimentos de xenotrasplantes para estudiar el comportamiento de las células en un estándar
Protocol
1. Aislamiento y cultivo de células madre humanas y la preparación para la inyección en embriones
- Las células madre humanas utilizadas como ejemplos en este protocolo (cerebro, tejido adiposo, la médula ósea) se encuentran aislados de manera diferente a los diferentes tejidos. Por ejemplo, células madre neurales adultas aisladas a partir de piezas de tejido recogidas de la pared ventricular del cerebro durante la neurocirugía endoscópica, que luego se disocia en las células individuales que son cultivadas in vitro. Las células madre neuronales se forman espontáneamente neuroesferas que flotan en el medio de cultivo, mientras que otros tipos de células se adhieren al fondo del plato 7. Derivadas de tejido adiposo células madre mesenquimales se obtienen a partir de material de liposucción que se digiere enzimáticamente y se esforzó para eliminar el tejido fibroso y luego se centrifuga para eliminar los adipocitos maduros. Las células resultantes se resuspenden en medio de cultivo suplementado con suero para promover la proliferación de las células madre en otros tipos de células madre hematopoyéticas y 8 células progenitoras pueden ser aislados de aspirados de médula ósea por la selección positiva utilizando anticuerpos específicos conjugados con partículas magnéticas (Myltenyi Biotec, Alemania o Dynal-Invitrogen, EE.UU.) y la separación de células magnéticas y / o el uso de anticuerpos conjugados con fluoróforos y de fluorescencia de clasificación de células activadas (FACS) 9.
- Para facilitar la posterior identificación, identificar a las células madre con un marcador fluorescente antes de la implantación en embriones de pollo. Las células madre pueden ser etiquetados con tintes fluorescentes lipofílicos como DII (Invitrogen, EE.UU.) o PKH26 (Sigma, EE.UU.), utilizando los protocolos recomendados proveedor hasta poco antes de la implantación, o, para una etiqueta permanente con esencia, no hay peligro de contaminación de las células huésped, pueden ser transducidas con el gen para una proteína fluorescente como la proteína fluorescente verde, utilizando vectores lentiviral, mientras que aún en la cultura 10.
- Protocolos para el cultivo y propagación de células madre humanas pueden variar. Protocolos detallados se pueden encontrar en la literatura. En pocas palabras, la formación de la esfera de células madre son generalmente cultivadas en frascos, mientras que las células madre son generalmente adherente en placas de Petri (que facilitan la trituración cuando se divide, ver más abajo), en un medio apropiado. Para el corte o cosecha, pellet ámbito de formación de las células por centrifugación de 5 minutos a 1200rpm y resuspender en pre-calentado tripsina / EDTA solución para no más de 5 minutos a 37 grados centígrados. Para células adherentes añadir la solución de tripsina / EDTA a la placa de Petri, y triturar al final de 5 minutos. Terminar la tripsina mediante la adición de Ca 2 +-medio que contiene, a veces se complementan con la albúmina. Para eliminar la tripsina / EDTA, centrifugar las células (5 min a 1200rpm), separar el sobrenadante, resuspender en el vehículo de inyección en frío (por lo general media o tampón fosfato salino), y centrifugar de nuevo (5 min a 1200rpm). Eliminar la mayor parte de este sobrenadante y resuspender suavemente las células para crear una suspensión de células de alta concentración.
- Mantener la suspensión de células madre humanas en un pequeño frasco tapado o un tubo de microcentrífuga en hielo durante varias horas antes de la inyección. La supervivencia en este estado puede ser del tipo celular dependiente. El vehículo de inyección debe ser optimizada de acuerdo a las propiedades de las células, incluyendo su adhesividad (por ejemplo, un vehículo de bajo Ca 2 + puede ayudar a prevenir la formación de grumos) y la resistencia a los cambios de la hipoxia y el pH.
2. De incubación de huevos y la preparación
- Tienda de los huevos fertilizados en una cámara de refrigeración (por ejemplo: Termaks, Bergen, Noruega) a los 14-15 ° C antes de la incubación. En esta evolución de la temperatura se detiene hasta que comienza la incubación. Los huevos fertilizados almacenados durante más de 10 días a temperaturas más bajas tienen un menor índice de desarrollo posterior y la supervivencia.
- Para reiniciar el desarrollo, poner los huevos en una incubadora humidificada, de tiro forzado (por ejemplo: Binder, Nueva York, EE.UU.) a 38-39 º C, y se incuban hasta la etapa de desarrollo deseado se alcanza (para la puesta en escena, véase la referencia 11. ).
- Antes de abrir el huevo, la creación de una bolsa de aire por encima del embrión mediante la inserción de una aguja de calibre 18 jeringa a través de la cáscara del huevo (no muy profundamente para evitar perforar la yema) y la evacuación de 4 ml de albúmina (figura A). Esto crea una caída de presión que en cuestión de minutos se iguala con la entrada de aire a través de la cáscara porosa. Cuando el aire entra recoge en el punto más alto dentro de la cáscara, separando así el embrión de la superficie interna de la cáscara.
- Sellar el agujero creado por la aguja de la jeringa con cinta de plástico convencionales.
3. Tirando de micropipetas de vidrio
- Tire de micropipetas de vidrio de borosilicato (por ejemplo, 1,2 mm OD x 0.94 mm de diámetro, Harvard Apparatus, EE.UU.) en un extractor de electrodos convencionales (por ejemplo, el modelo P-2000, Sutter Instruments, EE.UU.). Ajustar la configuración de extractor para obtener micropipetas que tienen alta resistencia de entrada cuando se usa como microelectrodes. Consejos debe ser aproximadamente de 1 a 1,5 cm de largo. Los ejes se pueden marcar a intervalos de 1 mm para el cálculo de volúmenes expulsado.
- Rompa las puntas de micropipeta de un tamaño viable, doblando con una pinza o empujar contra una superficie sólida, mientras que ver con un microscopio. La ruptura debe ser lo más uniforme posible en todo el perímetro del vidrio y el diámetro interno resultante en la punta debe adaptarse al tamaño de las células para ser utilizados sin que se tape. Normalmente, un 20-30 micrones de diámetro interior funciona bien.
4. Preparación de la solución rápida tinte verde (reactivo de contraste)
- Prepare una solución al 0,1% (w / v) de colorante verde rápido (Sigma-Aldrich, EE.UU.) mediante la disolución en solución salina fisiológica de pollo (137 mM NaCl, 5 KCl, CaCl2 2 mM, MgCl2 1 mM, 1 mM Na- fosfato, HEPES 5 mM, 11 mM de glucosa, pH 7,4).
- Filtrar la solución rápida a través de un verde 0,22 m Millex GP filtro (Millipore Co., Bedford, EE.UU.).
5. La apertura de los huevos y el contraste de los embriones
- Coloque dos trozos de cinta adhesiva en la parte superior del huevo, que abarca las dimensiones de la bolsa de aire. Mantener el huevo orientado de manera que el área de grabado (y por lo tanto la bolsa de aire) es más alta, corte una pequeña ventana dentro de las fronteras del área de grabado con una tijeras de disección resistente. La cinta incluye soporte y ayuda a prevenir los fragmentos de cáscara de huevo se cae sobre el embrión. Las burbujas de aire asociada con la bolsa de aire se pueden hacer estallar con la parte de atrás de una punta de la pipeta de plástico o sonda roma otros.
- Dibuja una solución Fast Green en una jeringa de 1 ml con una aguja de calibre 25. Eliminar las burbujas de aire en la jeringa y la aguja. Doblar la aguja a un ángulo de 45 grados, penetrar en un punto fuera de la placa embrionaria (identificados por el anillo de los vasos sanguíneos que se circunscriben, perforación dentro de la placa embrionaria aumenta la mortalidad) y con cuidado la aguja guía en el embrión. Inyectar el tinte hasta que el contraste deseado. El embrión, que normalmente es transparente, ahora se destacan como un fantasma blanquecino contra el color verde oscuro (figura B). Muchos investigadores el uso de tinta India (diluido al 10% v / v) en lugar de Fast Green. En este caso, es importante la utilización de tinta china que no es tóxico, como Pelikan Fount tinta china.
6. Hacer hindbrain y lesiones de la médula espinal del tubo neural
- Producir afilado agujas de tungsteno por la llama de grabado corto (2-3 cm) de 100 piezas de varilla de tungsteno micras de diámetro (número de catálogo 719000, A & R Sistemas, Seattle, Washington), con un soplete de acetileno / oxígeno. Esto se realiza mediante la inserción de la punta de la vara muy brevemente en la llama del soplete hasta que una chispa que se ve, lo que representa la erosión de explosivos de las capas externas de tungsteno, dejando tras de sí una punta afilada.
- Usando una aguja afilada de tungsteno, y cortar a través de desviar la membrana vitelina que cubre el área de microcirugía.
- En una segunda aguja afilada de tungsteno (la punta de la aguja primero es a menudo dañado después de cortar a través de la membrana vitelina y no es apta para la microcirugía posteriores), cortar cuidadosamente a través del epitelio del tubo neural y desviarla, luego se corta alrededor y debajo de la pieza del tubo neural que se retira, con movimientos cortos y rápidos hacia arriba (figura C). Hacer los cortes transversales y luego los cortes longitudinales es usualmente más exitosa. No corte demasiado profundo o se arriesga a penetrar en los vasos sanguíneos subyacentes, que generalmente es fatal.
- Mueva suavemente o arrastrar la pieza de tejido resecado lejos del sitio de la lesión con la aguja de tungsteno. Si esto resulta difícil, sino que también se puede quitar, por aspiración boca con una micropipeta de vidrio conectada a un tubo flexible.
7. La inyección de células madre humanas
a. La inyección en una lesión del tubo neural
Dibuja una pequeña cantidad de células en la punta de una micropipeta de vidrio por succión la boca mediante un tubo de plástico. La concentración de trabajo de la suspensión celular debe ser optimizado para el tipo de célula que se inyecta. Monte la micropipeta en un micromanipulador y conectarlo a una bomba de microinyector (por ejemplo: PV830 PicoPump neumático, IPM, Washington, EE.UU.). Bajo control visual, utilizando un microscopio de disección, guía de la punta de la micropipeta en la lesión y cuidadosamente saque a las células mediante el aumento de la presión del aire (ya sea por pulsos de presión constante o de forma gradual el aumento gradual de la presión) (Figura C). Cuando la cantidad deseada de células se deposita en el sitio de la lesión, con cuidado retirar la micropipeta.
b. La inyección en el lumen del tubo neural
En algunos casos puede ser conveniente para inyectar las células en los ventrículos del cerebro en desarrollo, por ejemplo si las células son invasivas suficiente para ganar acceso al tejido neuronal en ausencia de lesiones. La inyección de células en el lumen de los brain región requiere el uso de una etapa de desarrollo en el que la luz ofrece un receptáculo lo suficientemente grande y es de fácil acceso; etapas HH 12-18 son favorables en este sentido. Una lesión no es necesario. Simplemente perforar la pared del tubo neural con la micropipeta de vidrio antes de la inyección de las células. Los elementos clave para el éxito de este método son la nitidez de la micropipeta y la brusquedad de la penetración, muy lento el movimiento y la punta de la micropipeta sólo hoyo en la pared del tubo neural, sin penetrar.
c. Inyección sistémica
Inyecciones sistémicas se pueden hacer a través de los vasos sanguíneos extra-embrionario (a partir de la etapa HH 15, cuando los buques están bien desarrollados). Esto no es poco común acompañado de un poco de sangrado, y ya que hay muchas pequeñas arterias y venas más grandes menos, intra-arterial inyecciones son generalmente más seguras cuando se trata de la supervivencia del embrión. Por otro lado, inyecciones intravenosas proporcionar un acceso más rápido de las células del corazón y por lo tanto probablemente una distribución más equitativa de las células. Una inyección de éxito requiere una micropipeta afilada con un diámetro menor que el buque de destino. Acercarse a la embarcación a lo largo de su eje en un ángulo pequeño respecto a la horizontal (unos 30 grados). Empuje la micropipeta contra el buque hasta que el barco comienza a ocluir. A continuación, pulse más de una empresa, el movimiento brusco de penetrar. Retraer lentamente hasta que la sangre se ve a llamar por la acción capilar en la punta de la micropipeta. La inyección de células se debe realizar con una presión constante, después de que la micropipeta se retira con un movimiento rápido.
8. Sellado del huevo
- Después de la inyección, deje que el huevo de pie quieto durante unos minutos para permitir que las células inyectadas para resolver y cumplir. Para evitar la deshidratación (que puede ocurrir rápidamente y puede ser mortal), poner un pedazo de tejido húmedo o papel de filtro en la ventana durante este período de descanso.
- Después de unos minutos y las células se han establecido, la cáscara seca alrededor de la ventana y el sello de la ventana con cinta de plástico convencionales. Asegúrese de que este sello es firme y que no la albúmina puede a través de la apertura o entre el depósito y la cinta (con frecuencia es fatal durante la incubación posterior).
- Vuelva a colocar los huevos a la incubadora de tiro forzado para un mayor desarrollo. La observación puede hacerse a intervalos mediante la eliminación de la cinta sobre la ventana.
9. La disección de embriones
- Una vez que el embrión se ha llegado a la etapa deseada, crack abrir el huevo en un tazón de helado de solución salina fisiológica o buffer fosfato salino (la cinta que cubre la ventana debe ser el primer corte para permitir que las dos mitades de la cáscara del huevo para separar). La solución salina helada sirve para anestesiar el embrión de la hipotermia. El corazón debe disminuir rápidamente y detener a un par de minutos.
- Separar el embrión a partir de las membranas extraembrionarias y el escenario que con ref. 11.
- Decapitar a los embriones, la transferencia a un plato de disección que tiene un piso de caucho de silicona y solución salina oxigenada contiene fisiológicas suplementado con glucosa (137 mM NaCl, 5 KCl, CaCl2 2 mM, MgCl2 1 mM, 1 mM Na-fosfato, 5 mM HEPES, 11 mM de glucosa, pH 7,4) y el pin lado ventral hacia arriba rápido. Retire las vísceras abdominales y torácicas. Usando una tijera en ángulo, hacer incisiones longitudinales a lo largo de cada aspecto ventrolateral de la columna vertebral. Especialmente en las etapas posteriores (después de 6 días de desarrollo), la incisión inicial se realiza mejor en la región lumbosacra, donde el espacio entre las vértebras y la médula espinal es mayor. Retire la cara ventral de la columna vertebral para revelar la médula espinal. Asegúrese de que la solución salina fisiológica sigue siendo oxigenada por burbujeo en unos intervalos de 10 minutos con oxígeno medicinal puro.
- Corte con cuidado las raíces dorsales y ventrales naciente a cada lado, transecto de la médula espinal en los niveles deseados, y sacarlo con cuidado del canal vertebral. La médula espinal va a sobrevivir durante muchas horas en este estado y puede ser sometido a 12 anatómicos y fisiológicos 13,14 experimentos.
Figura 1. A) El enfoque adecuado para la evacuación de la albúmina. Tenga en cuenta la posición del embrión y la colocación de la aguja. B) En contraste de los embriones. Tenga en cuenta el punto de penetración de la aguja fuera del disco embrionario. C) Representación esquemática del procedimiento para la lesión medular unilateral del tubo neural seguida de trasplante de células.
Discussion
El embrión de pollo es un modelo animal conveniente y versátil para los experimentos de xenotrasplante. La falta de un sistema inmune funcional durante el desarrollo embrionario y fetal, permite la supervivencia y el desarrollo de las células de cualquier especie que tolera la temperatura de incubación. Embriones de pollo se han utilizado para poner a prueba el potencial regenerativo de los distintos tipos de células madre (revisado en ref. 15). Las células de mamíferos madre pueden integrarse en los tejidos de embrión de pollo, incluyendo el sistema nervioso central, donde pueden dar lugar a neuronas cuyas proyecciones axonal, la conectividad sináptica y las propiedades electrofisiológicas se puede evaluar en el contexto del 1,2 funcional circuitos neuronales.
Debido a que los procedimientos quirúrgicos son relativamente fáciles, y las inyecciones se realizan bajo el control visual en lugar de estereotáxica, el número de embriones se puede incrementar fácilmente para adaptarse a diferentes condiciones experimentales en un solo experimento. Normalmente las células se pueden inyectar en 20-30 embriones dentro de un experimento de cuatro horas. La mortalidad después de la inyección de los embriones es el principal factor limitante. Se deben tomar precauciones para evitar la hemorragia y la deshidratación. Tenga en cuenta que hay ciertas etapas críticas del desarrollo en que los aumentos naturales de la tasa de mortalidad. Que complementa el embrión con unos pocos mL de inyección caliente, esterilizados timbre de pollo y el día siguiente antes de las etapas críticas del desarrollo, así como asegurar que la ventana en el huevo esté bien sellada y orientada a evitar las fugas, mejora la supervivencia. Si la fuga a través del precinto debe ocurrir, retire la cinta, secar las superficies y volver a la cinta. Algunos investigadores utilizan la cera y el vidrio o cubreobjetos de plástico para sellar la ventana. La mortalidad no debe ser sustancialmente diferente en comparación con inyección de operación simulada embriones.
Aunque nos hemos centrado aquí en la inyección de células madre humanas en el esbozo del cerebro y la médula espinal, las células madre también pueden ser inyectados en el esbozo de otros órganos (véase, por ejemplo, ref. 4). Cada órgano plantea sus propios desafíos. Por ejemplo, la inyección en el corazón puede ser un reto debido a la alta resistencia mecánica a la penetración de la pipeta y debido a los movimientos, que por otro lado puede ser frenado por el enfriamiento de los embriones a temperatura ambiente antes de la inyección. Los órganos que carecen de una luz no puede dar cabida a la inyección de un volumen suficiente y por lo tanto puede requerir lesión quirúrgica para crear un receptáculo. En nuestra experiencia, después de la lesión la regeneración de tejidos es una ventaja, ya que promueve la integración de las células madre humanas en el tejido. Las células también pueden ser inyectados en mesénquima embrionario, como el mesénquima somitic dispersión o de la cresta neural migran como una forma de lograr su incorporación en derivados mesenquimales, incluyendo la cresta neural derivados de los ganglios periféricos 16,17.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
El trabajo fue apoyado por becas de Helse og Rehabilitering (JLB), el Consejo Noruego de Investigación (GH y GCC) y la Universidad de Oslo (NK y JCG).
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescent microscope | Microscope | Olympus Corporation | ||
| Stereo Investigator | Program | MBF Bioscience | ||
| MIP-GFP mice | Mice | Jackson Laboratory | ||
| Mathematica | Program | Wolfram | ||
| Image J | Program | National Institutes of Health | ||
| Slidebook | Program | Olympus Corporation |
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