ニワトリ胚へのヒト幹細胞の異種移植

Summary

本稿では、ニワトリ胚の中枢神経系の様々な領域にヒト幹細胞を移植するための手法を提案する。これが用意されています

Abstract

ニワトリ胚は、標準化における細胞の挙動を研究するために、通常の胚と胎児の発育を研究するためと異種移植実験のための古典的な動物モデルである

Protocol

1。胚に注入するためのヒト幹細胞と準備の単離および培養

1. このプロトコルの例（脳、脂肪、骨髄）として使用されるヒト幹細胞は、異なる組織とは異なる方法で分離されています。例えば、成人の神経幹細胞はin vitroで培養されている個々の細胞にして解離して内視鏡外科、中脳の脳室壁から採取した組織片から分離されています。神経幹細胞は、自発的に他の種類の細胞が培養皿の⁷の底部に付着しながら培養培地中に浮遊するニューロスフェアを形成する。脂肪由来間葉系幹細胞は酵素消化し、線維組織を除去するために緊張して、成熟した脂肪細胞を取り除くために遠心分離された脂肪吸引の材料から得ています。得られた細胞は、他の細胞タイプ⁸造血幹細胞および前駆細胞を介して幹細胞の増殖を促進するために血清を添加した培養液で再懸濁した磁性粒子（Myltenyi Biotec社、ドイツに結合した特異的な抗体を用いてポジティブセレクションによるヒト骨髄液から単離することができるまたはDYNAL -インビトロジェン社、米国）と磁気細胞分離、および/ ​​または蛍光物質および蛍光活性化細胞選別^{（FACS）9〜}標識抗体を使用。
2. ニワトリ胚に移植前に蛍光マーカーを後で識別、ラベル幹細胞を容易にする。幹細胞は、宿主細胞を汚染の本質的に危険性がないとの永続的なラベルのため、すぐに着床前までのサプライヤー推奨のプロトコルを使用してこのようなDII（インビトロジェン社、米国）またはPKH26（Sigma、米国）等の蛍光親油性色素で標識し、またはすることができます彼らはまだ文化¹⁰の間に、レンチウイルスベクターを使用して、緑色蛍光タンパク質などの蛍光タンパク質の遺伝子を形質導入することができます。
3. ヒト幹細胞の培養と増殖のためのプロトコルは異なります。詳細なプロトコールは、文献で見つけることができます。接着幹細胞は通常、適当な培地で、（時分割粉砕を容易にする、下記参照）ペトリ皿で​​培養されているのに対し、簡単に言えば、球形成幹細胞は、通常、フラスコ内で培養されています。分割または収穫のため、1200rpmで5分の遠心分離によってペレット球形成細胞と37℃でせいぜい5分間予め温めておいたトリプシン/ EDTA溶液で再懸濁します。接着細胞用シャーレにトリプシン/ EDTA溶液を加え、5分間の最後でひいて粉にする。時にはアルブミンで補完のCa ^{2 +}含有培地を、追加することによって、トリプシン処理を終了します。トリプシン/ EDTAを削除するには、細胞を（1200rpm、5分間）遠心分離、コールドインジェクション車（通常は培地またはリン酸緩衝生理食塩水）で再懸濁し、上清を、削除し、（1200rpmで5分）、再度遠心する。この上清の大部分を削除して、ゆっくりと高濃度の細胞懸濁液を作成するために細胞を懸濁します。
4. 最大で数時間前まで注射まで氷上で小さな、キャップ付きバイアルまたはマイクロ遠心チューブにヒト幹細胞の懸濁液を保管してください。この状態での生存率は細胞タイプに依存する可能性があります。インジェクション車両は、その接着力（例：低Ca ^{2 +}車両が凝集防ぐことができる）と低酸素とpHの変化に対する抵抗を含めて、細胞の性質に応じて最適化されている必要があります。

2。卵の孵化と準備

1. ° Cインキュベーション前に14〜15時：冷却室（Termaks、ベルゲン、ノルウェーなど）で受精卵を保存してください。インキュベーションが開始されるまでこの温度の開発で逮捕されている。約10日間以上またはより低い温度で保存された受精卵は、その後の発展と生存率の低下を持っている。
2. 加湿、強制通風インキュベーター（例：バインダー、ニューヨーク、米国）に卵を置く、開発の再開への° Cは38から39までで、開発の必要な段階に到達するまでインキュベートする（ステージング用、refを参照してください11。 ）。
3. 卵を開く前に、（図A）卵の殻（あまりにも深く卵黄にピアスを避けるために）を介して18ゲージの注射針を挿入し、アルブミンの4mlを排気することで胚の上の空気のポケットを作成します。これは数分で多孔質外殻を通過する空気のエントリで、イコライズされた圧力降下を作成します。空気が入るとそれは、このようにシェルの内面から胚を分離し、シェル内で最も高いポイントで収集します。
4. 従来のプラスチックテープで注射器の針で作成された穴を塞ぐ。

3。ガラスのマイクロピペットを引っ張る

1. 従来の電極プラー上のホウケイ酸ガラス（例えば、1.2ミリメートル外径× 0.94ミリメートルのID、ハーバード装置、米国）（例えば、モデルP - 2000、サターインスツルメンツ、米国）からガラスのマイクロピペットを引き出します。 microelとして使用した場合、高入力抵抗を持っているマイクロピペットを得るためにプーラーの設定を調整しますectrodes。ヒントは、約1〜1.5センチメートル長いはずです。シャフトは、取り出されたボリュームを計算する1 mm間隔でマークすることができます。
2. 鉗子でそれらを曲げたり、顕微鏡で見ながら、固体表面に対してそれらを押すことにより実行可能なサイズにマイクロピペットの先端を破る。ブレークは、ガラスの周囲などにも可能な限りでなければならず、先端における結果の内径が詰まることなく、使用する細胞の大きさに対応する必要があります。通常は20〜30ミクロンの内径はうまく動作します。

4。ファストグリーン色素溶液の調製（試薬を対照的な）

1. （137 mMのNaCl、5mMのKClを、2mMのCaCl _2を 、1mMのMgCl _2、1mMの鶏生理食塩水に溶解してファストグリーン色素（Sigma - Aldrich社、米国）の0.1％（w / v）溶液を準備するのNa -リン酸、5mMのHEPES、11 mMグルコース、pH7.4）に。
2. 0.22μmのマイレクスGPフィルター（ミリポア社、ベッドフォード、米国）を介して高速グリーンソリューションをフィルタリングする。

5。卵を開くと胚を対照

1. エアポケットの大きさをカバーする、卵の上にテープの2個を置きます。卵の向きを保つことは録音されたエリア（と、空気のポケットが）一番上になるように、頑丈な解剖鋏を使って録音された領域の境界線の中に小さなウィンドウをカット。テープはサポートが追加され、胚に落下するから卵殻の破片を防ぐのに役立ちます。エアポケットに関連付けられている気泡は、プラスチック製のピペットチップまたは他の鈍プローブのバックエンドを使用してポップすることができます。
2. 25ゲージの針を1 mlシリンジにいくつかのファストグリーンソリューションを描く。注射器と針で気泡を取り除く。 45度の角度に針を曲げたり、胚性プレート（それを外接血管のリングで識別される、胚性プレートの増加、死亡率の中ピアス）の外側の点で侵入し、慎重に胚の下に針先をご案内。希望のコントラストが得られるまで色素を注入する。通常は透明である胚は、、今暗緑色（図B）に対して白っぽい幽霊として頭角を現すはず。多くの研究者らは、インドのインク（10％v / vのために希釈）ではなく、ファストグリーンを使用してください。このケースでは、ペリカンファウントインディアインクのような、非毒性であるインドのインクを使用することが重要です。

6。後脳と脊髄神経管の病変を作る

1. アセチレン/酸素トーチで、直径100μmのタングステンロッド（カタログ番号719000、A＆Rシステム、シアトル、ワシントン州）の短い（2-3センチ）の部分を難エッチングによるシャープタングステン針を生産する。これは、火花が見えるまで鋭い先端を残して、タングステンの外側の層の爆発的な浸食を表す、トーチ炎に非常に簡単にロッドの先端を挿入することによって行われます。
2. シャープタングステン針を用いて、通過スライスし、顕微鏡のためのエリアをカバーして卵黄膜を偏向させる。
3. 第二シャープタングステン針を（最初の針の先端はしばしば卵黄膜を介してスライスした後、破損やその後の顕微鏡に適合されていない）を使用して、神経管を覆う上皮を通して慎重に切り取って、それを偏向させ、その後の周りにカットアンドピースの下に神経管の短い、クイック上向きストローク（図C）を使用して、削除する。縦カット、最初の横カットを作るとすると、通常、最も成功しています。あまりにも深くカットしたり、通常は致命的な基盤となる血管を、貫通リスクにさらさないでください。
4. 静かにタングステン針を用いて病変部位から切除した組織片を反転またはドラッグします。これが困難な証明された場合、それはまた、フレキシブルチューブに接続されているガラスのマイクロピペットを用いて口の吸引によって除去することができます。

7。ヒト幹細胞の注入

A.神経管の病変への注射

プラスチック製のチューブを使用して口の吸引によるガラスのマイクロピペットの先端に細胞の少量を描く。細胞懸濁液の使用濃度は、注入される細胞の種類に合わせて最適化されている必要があります。マイクロマニピュレータ上にマイクロピペットをマウントし、インジェクターポンプ（例：PV830空気圧PicoPump、WPI、ワシントン、米国）に接続してください。解剖顕微鏡を使って視覚的な制御の下で、病変にマイクロピペットの先端をガイドし、慎重に空気の圧力（どちら定圧のパルスにより、または徐々に圧力を上昇させて）（図C）を増加させることによって細胞を追放する。細胞の所望量の病変部位内に堆積されている場合、慎重にマイクロピペットを撤回。

B.神経管の内腔への注射

細胞は病変の存在下で神経組織へのアクセスを得るのに十分な侵襲であればいくつかのケースでは、例えば、発展途上脳室に細胞を注入することが望ましい場合があります。どんなBRの内腔への細胞の注入AIN地域は、内腔が十分な大きさの容器を提供し、容易にアクセスされる発達段階を使用する必要があります。HHステージ12〜18は、この点で有利です。病変は必要ありません。単に穴を開ける前に、細胞の注入にガラスのマイクロピペットで神経管の壁。この方法の成功の鍵となる要素は、マイクロピペットと浸透のぶっきらぼうな鋭さです。すぎて動きを遅くし、マイクロピペットの先端は貫通せずに神経管の壁をディンプルことができる。

C.全身注射

全身注射は、余分な胚の血管（これらの血管がよく発達しているHHステージ15から始まる）を経由して行うことができます。これは、まれに、一部出血を伴って、多くの小動脈と少数の大静脈があるので、それは胚の生存率となると、動脈内注射は、一般的に安全ですされていません。一方、静脈内注射は、心臓への細胞の迅速なアクセスそしておそらく細胞の均等な分布を提供しています。成功注入は標的血管よりも小さい直径を持つシャープなマイクロピペットを必要とする。 （約30度）、横から小さな角度で、その軸に沿って船に近づく。血管が閉塞するために開始されるまで船舶に対してマイクロピペットを押し込みます。その後、事務所、浸透する急激な運動でさらに押し込みます。血液をマイクロピペットの先端に毛細管現象により描画するために見られるまで、ゆっくり引き戻します。細胞の注入は、マイクロピペットの迅速な移動で退避された後、一定の圧力を使用して実行する必要があります。

8。卵のシール

1. 注入後、注入した細胞が定着して付着できるように、数分間卵はまだ放置。 （すぐに発生する可能性があると致命的な証明ができる）脱水を避けるために、この残りの期間中にウィンドウの上に湿らせたティッシュやろ紙片を置く。
2. 数分と細胞が定着した後、ウィンドウの周りにシェルを乾燥し、従来のプラスチックテープで窓をシール。このシールがタイトであるとはアルブミン（これは多くの場合、その後のインキュベーション中に致命的な証明）の開口部を介して、またはシェルとテープの間に漏れていないことを確認してください。
3. さらなる発展のために強制通風のインキュベーターに卵を交換してください。観察は、ウィンドウの上にテープを除去することにより、一定の間隔で行うことができます。

9。胚の解剖

1. 一度胚が望ましい段階に達している、氷冷生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水（窓を覆って、テープが別個に卵殻の二つの部分を可能にするために、最初のカットしてください）​​。のボウルに卵を開口割れ目氷冷生理食塩水は、低体温によって胚を麻酔しています。心臓はすぐに遅くなると数分以内に停止する必要があります。
2. 胚体外膜から胚を分離し、refを使用して、それをステージ。 11。
3. シリコーンゴムのフロアがあり、グルコース（137 mMのNaCl、5mMのKClを、2mMのCaCl _2を 、1mMのMgCl _2、1mMのリン酸ナトリウム、5を添加した酸素生理食塩水を含む解剖皿にそれを転送し、胚を刎ねるmMのHEPES、11 mMグルコース、pH7.4）およびその高速な腹側をピン。腹部と胸部内臓を取り除く。角度のはさみを使用して、脊柱のそれぞれの腹の側面に沿って縦切開を行います。特に後の段階（開発の6日後）で、最初の切開は、最高の脊椎と脊髄の間にスペースが最大になる腰仙部の地域で作られています。脊髄を明らかにするために脊柱の腹側面を取り外します。生理食塩水は純粋な医療用酸素で約10分間隔でバブリングすることにより酸素残っていることを確認してください。
4. 慎重に、両側に発生期の背側と腹側の根を切る必要なレベルで脊髄を横断する、穏やかに脊柱管から持ち上げます。脊髄はこの状態で数時間かけて生き残っていくだろうと解剖学¹²と生理^13,14実験に供することができる。

図1。）アルブミンの避難のための適切なアプローチ。胚の位置と針の位置に注意してください。 B）胚の対照的。胚盤外針の浸透の点に注意してください。 C）一方的な脊髄神経管の病変のための手順の模式図は、細胞移植が続きます。

Discussion

ニワトリ胚は、異種移植の実験のための便利で多目的な動物モデルである。胚や胎児の発達中に機能的な免疫システムの欠如は、インキュベーションの温度を許容する任意の種由来の細胞の生存と発展を可能にする。ニワトリ胚は、幹細胞（refにレビュー。15）の様々な種類の再生可能性をテストするために使用されている。哺乳類の幹細胞は、彼らがその軸索投射ニューロンを生み出すことができる中枢神経系、を含むニワトリ胚の組織に統合できる、シナプスの接続性と電気生理学的特性は、機能的神経回路の^1,2のコンテキストで評価することができる。

外科手術が比較的容易であり、注射ではなく、定位の制御を視覚的に下に行われるため、胚の数は、簡単に一回の実験内の異なる実験条件に対応するために増加することができます。一般的に細胞を4時間の実験中20から30胚に注入することができます。胚のポスト噴射の死亡率は、主要な制限要因である。注意事項は、出血と脱水を避けるように注意する必要があります。自然死亡率の増加で、特定の重要な発達段階があることに注意してください。重要な発達段階の前に暖かい、滅菌チキンリンガー以下の注射と一日の数mLで胚を補うだけでなく、卵のウィンドウは、漏れを避けるために、しっかりと密封されてと志向であることを確認、生存率を向上させます。テープシールによる漏れが発生した場合、テープを取り外し表面および再テープを乾燥させる。一部の研究者は、ウィンドウを密封するためにワックスやガラスまたはプラスチック製のカバースリップを使用してください。死亡率は、偽手術胚対注入で大幅に異なってはいけません。

我々は脳と脊髄の原基にヒト幹細胞の注入にここに焦点を当てているが、幹細胞はまた、他の臓器の原基（例REFの4参照）に注入することができます。各器官は独自の課題となっています。例えば、心臓への注射が原因ピペットの浸透に高い機械的抵抗をしているため、他の一方で注射前に室温に胚を冷却することによって減速することができるの動き、の挑戦することができます。内腔を欠いている器官は、十分な量の注入に対応していない可能性があり、外科的病変は、レセプタクルを作成するために必要となる場合があります。それが組織にヒト幹細胞の統合を促進するため我々の経験では、後の病変組織再生が有利です。細胞はまた、そのような神経堤由来の末梢神経節^16,17を含む間葉系誘導体、中に取り込みを達成する手段として分散体節間葉または移行する神経堤などの胚間充織に注入することができます。

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Fluorescent microscope	Microscope	Olympus Corporation
Stereo Investigator	Program	MBF Bioscience
MIP-GFP mice	Mice	Jackson Laboratory
Mathematica	Program	Wolfram
Image J	Program	National Institutes of Health
Slidebook	Program	Olympus Corporation