Summary
Pseudofracture, um modelo reprodutível murino de trauma músculo-esquelético estéril, permite a avaliação de final de mandato pós-traumático respostas imunes. Este artigo descreve a execução processual do modelo passo a passo, incluindo a possibilidade de combinações de modelo experimental para permitir estudo de trauma múltiplo.
Abstract
Após o trauma não é uma resposta hiper-reativa início inflamatória que pode levar à disfunção de múltiplos órgãos e mortalidade em pacientes com trauma; esta resposta é muitas vezes acompanhada por uma imunossupressão atrasada que adiciona as complicações clínicas da infecção e também pode aumentar a mortalidade 1-9. Muitos estudos já começaram a avaliar essas alterações na reatividade do sistema imune após o trauma. 10-15
Estudos imunológicos são muito apoiados através da grande variedade de transgênicos e camundongos knockout disponíveis na modelagem vivo;. Destas cepas ajuda nas investigações detalhadas para avaliar as vias moleculares envolvidos nas respostas imunológicas 16-21
O desafio na modelagem experimental murino trauma é a investigação de longo prazo, como as técnicas de fixação de fratura em camundongos, pode ser complexo e não é facilmente reproduzível. 22-30
Este modelo pseudofracture, um modelo de trauma facilmente reproduzido, supera essas dificuldades imunologicamente imitando um ambiente fratura extremidade, permitindo liberdade de movimentos dos animais ea sobrevivência a longo prazo sem o uso contínuo e prolongado de anestesia. A intenção é recriar as características de fratura de ossos longos; músculo lesionado e tecidos moles são expostos a danos no osso e da medula óssea sem quebrar o osso nativo.
O modelo pseudofracture consiste de duas partes: a lesão por esmagamento bilateral do músculo de membros posteriores, seguida pela injeção de uma solução para estes músculos osso lesionado. A solução osso é preparado pela colheita dos ossos longos dos dois membros posteriores de uma idade e peso-dador singeneicos. Estes ossos são então esmagados e ressuspenso em tampão fosfato salino para criar a solução óssea.
Fratura de fêmur bilateral é um modelo comumente usados e bem estabelecida de trauma extremo, e foi o modelo comparativo durante o desenvolvimento do modelo pseudofracture. Entre a variedade de modelos disponíveis fratura, optamos por utilizar um método fechado de fratura com lesão de tecidos moles como a nossa comparação com o pseudofracture, como queríamos um estéril ainda proporcionalmente grave trauma modelo periférica tecido. 31
Choque hemorrágico é um achado comum no cenário de trauma grave, ea hipoperfusão mundial adiciona um elemento muito relevante para um modelo de trauma. 32-36 O modelo pseudofracture pode ser facilmente combinada com um modelo de choque hemorrágico de um modelo de trauma múltiplo de alta severidade 37.
Protocol
1. Instrumento e Preparação do campo cirúrgico:
Todos os procedimentos experimentais são realizadas usando técnicas assépticas. Antes de começar, a área experimental devem ser cuidadosamente limpos e esterilizados. A bancada deve ser desinfetada, secas ao ar e depois limpo com álcool 70%. Coloque uma almofada cirúrgica azul e campo estéril vestir na área de trabalho experimental.
Todos os materiais e instrumentos são esterilizados em autoclave antes de usar. Seringas e agulhas estéreis são recebidos. O pesquisador deve ser adequadamente vestida com jaleco, máscara cirúrgica e luvas cirúrgicas estéreis.
Nossos instrumentos cirúrgicos são esterilizados em autoclave a cada noite. Eles são lavados após a cirurgia usando sabão antibacteriano e água. Eles são autorizados a seca em uma almofada cirúrgica limpa azul. Em seguida, são cuidadosamente colocadas em uma bolsa de esterilização e esterilizado para uso posterior.
Ligue o esterilizador quente talão para garantir que ele atinja a temperatura adequada - 300-350 ° F antes de iniciar o experimento. Este esterilizador será usado para limpar instrumentos entre procedimentos experimentais em ratos respectivos. Obter uma bandeja de instrumentos de aço inoxidável e preenchê-lo 03/01 do caminho com etanol 70%. Não deve ser suficiente etanol 70% para cobrir seus instrumentos cirúrgicos. Ligue a almofada de aquecimento circulando e coloque uma almofada cirúrgica azul sobre ele e em seguida, um campo estéril vestir em cima disso. Este aquecedor é usado para assegurar calor adequado do mouse durante o procedimento experimental e período de recuperação. Coloque todos os instrumentos esterilizados, gaze, seringas, agulhas e um tubo de microcentrífuga 1,5 mL sobre o curativo campo estéril. Tenha cuidado ao abrir qualquer instrumentos esterilizados e outros itens, não os contaminar por tocá-los. O melhor é usar luvas estéreis quando se faz este procedimento de instalação.
2. Modelo Pseudofracture - Procedimentos Experimentais:
1. Indução da anestesia e posicionamento do mouse.
Começar pela administração de uma injeção intraperitoneal de Pentobarbitol (70mg/kg). Isto é realizado pelo primeiro levantamento do mouse de sua jaula usando a extremidade proximal da cauda. O mouse deve, então, a pesagem para calcular a dosagem correta de anestésico. Em seguida, coloque o animal em cima da gaiola enquanto ainda segurando sua cauda. Agarrar a nuca do mouse com o polegar eo dedo médio de cada lado do mouse logo atrás da patas dianteiras. O dedo indicador é usado para puxar a pele na região da cabeça / pescoço, costas e parcialmente imobilizar a cabeça. Cauda do rato é realizada entre o dedo mindinho e do dedo anelar enquanto o dedo anelar é pressionado para a região lombar da coluna vertebral do rato. A anestesia deve ter pleno efeito em aproximadamente 5 minutos, e deve ser confirmado com o teste do reflexo.
Depois que o animal está dormindo, coloque o mouse na posição supina em uma placa de acrílico e usar uma técnica de fita solta loop para imobilizá-los gravando suas extremidades. A técnica de laço solto implica simplesmente cortar tiras finas de fita e envolver a fita solta ao redor da porção distal de cada extremidade. A fita é então preso de volta para si e os que sobraram de fita está conectada à placa. Isto permite a manipulação experimental a ser realizado de uma forma consistente, bem como assegurar as extremidades dos ratos assumir uma posição mais natural. Regiões abdominal, inguinal e coxa do animal são, então, raspada usando nosso tosquiadeiras Oster A5 (lâmina de tamanho 40), para ajudar a manter um campo estéril. A gaze 4x4 é adocicada com betadine e da área cirúrgica é então limpou para esterilizar. Um curativo campo estéril é então dobrada e cruzando o mouse para permitir a exposição de apenas as extremidades inferiores e na cabeça.
Após imobilização e esterilização, colocar um cone de nariz com isoflurano sobre o nariz do mouse por alguns segundos antes de começar o procedimento experimental. O cone do nariz consiste de um tubo cônico 50cc preenchido com gaze. Metade da extremidade inferior do tubo é cortado criando um espaço para o nariz do rato para se encaixar. A tampa (fundo de um recipiente de armazenamento de tecidos ou seja, em linha reta lado frasco de boca larga) é colocada sobre a extremidade cortada do cone para garantir os vapores isoflurano permanecem no tubo quando não em uso. Um ml de isoflurano deve ser adicionado ao gaze dentro do cone. Atenção meticulosa deve ser dada para o mouse durante o uso de anestesia e especialmente a utilização de isoflurano através do cone do nariz. Uma vez que o animal respirações começam a diminuir, o experimento pode começar, eo cone do nariz deve ser removido e fechado.
Se a anestesia adicional é necessário durante qualquer parte do experimento, pentobarbital adicionais podem ser injetados ou isoflurano administrado. Métodos alternativos de administração de isofluorano estão disponíveis e atualizadas as orientações Recommacabar com o uso de um vaporizador de precisão para permitir um melhor controle da anestesia, se possível. No entanto, atenção à fisiologia respiratória do mouse deve ser garantida com qualquer um destes métodos.
2. Pseudofracture experimento.
Pseudo-fratura é uma combinação de lesões de tecidos moles seguido de injeção osso solução para o músculo lesionado e é realizada bilateralmente para membros posteriores. A solução óssea devem ser preparados antes de qualquer manipulação experimental dos camundongos destinatário começa.
3. Solução de preparação óssea.
A solução óssea preparados a partir de um camundongo doador será suficiente para 3 ratos destinatário. Um camundongo doador singeneicos deve ser usado que é a idade e peso combinado ao mouse destinatário experimental.
O camundongo doador serão sacrificados com isoflurano inalado. O doador será gravado para a placa de acrílico com muita atenção para a fita nas extremidades inferiores apenas na ponta do pé. As extremidades inferiores devem ser cuidadosamente raspada e completamente coberta de betadine, e depois limpas com álcool para esterilidade. Em seguida, o fêmur ea tíbia será removido cirurgicamente de forma estéril de ambos os membros inferiores. Para remover os ossos longos dos membros inferiores, faça uma incisão cirúrgica na pele na região inguinal, e continuar a cortar a pele ao longo do comprimento da extremidade, até o tornozelo. Retrair a pele, e dissecá-lo longe da fáscia subcutânea e muscular tanto nos aspectos medial e lateral para a exposição máxima. Inserir uma lâmina da tesoura sob os músculos que se encontram anterior e lateral do (tibial anterior, extensor longo dos dedos, longus hallicus extensor, fibular longo, fibular brevis) tíbia e deslizar a lâmina proximal e distalmente para levantar os músculos de forma limpa longe do subjacente do osso. Repita esta técnica na parte inferior posterior e medial da tíbia para separar os músculos debaixo da tíbia (gastrocnêmio, sóleo, tibial plantar, posterior, flexor longo dos dedos, flexor longo hallicus). Um mínimo esforço adicional deve ser usado no lado posterior distalmente ao deslizar, de modo a tirar a fíbula longe da tíbia. No final proximal destes músculos da perna corte os tendões tão perto de suas inserções possível e retrair os músculos distais, enquanto puxando o grupo muscular juntos em moda para baixo um puxão pequena vai liberar os anexos distal dos músculos da articulação do tornozelo. A articulação do tornozelo pode ser cortado por meio diretamente com a tesoura. Não remova a tíbia do fêmur neste momento! Esta conexão permite alavancar adicionais que irão ajudar na dissecção do fêmur a partir da articulação do quadril. Siga uma técnica similar para a liberação dos músculos do fêmur e executar este posteriormente e ambos medial e lateralmente também, se necessário. Cortar o apego distal desses grupos musculares para libertá-los da articulação do joelho. Continue a dissecção e siga por baixo os músculos para dissecar o fim do fêmur para fora da articulação do quadril. Para ajudar neste dissecção, a incisão na pele deve ser alargado, na medida do necessário para alcançar uma exposição adequada. Movimento do fêmur na articulação do quadril podem ajudar a localizar a extremidade proximal do fêmur durante a dissecção.
Uma vez que o fêmur (com tíbia em anexo) é removido do camundongo doador colocá-los em um 4x4gauze estéril. Os dois ossos podem ser separados na articulação do joelho simplesmente pegando cada osso em uma mão separada e gentilmente torção / rotação dos dois ossos em direções opostas ao longo de seu eixo longitudinal. Dissecção delicada e manuseio desses dois ossos é recomendada como eles podem ser facilmente fraturados com qualquer esforço sobre-da manipulação manual. Para remover os anexos tendão remanescentes dos ossos longos, use um pedaço de gaze seca e esterilizada 4x4 envolvida em torno do comprimento do osso. Segure esta gaze firmemente contra o osso uma puxá-lo a todo o comprimento do osso várias vezes, isso vai raspar o resto de tecidos da superfície do osso como eles vão aderir à gaze e ser rápida e facilmente se afastou dos ossos. Os ossos coletados devem então ser colocado diretamente em um tubo de microcentrífuga estéril 1,5 ml e colocado no gelo para o transporte.
Estes quatro ossos de doadores será levado para uma cabine de segurança biológica para a preparação para a solução do osso. A coifa deve ser desinfetados antes do uso, coloque um campo estéril molho sobre a área de trabalho dentro do capô. Coloque um almofariz e pilão estéril, tubo de 8ml estéril e fosfato estéril Buffered Saline (PBS) na área de trabalho. A pipetteman 1mL e dicas respectivos devem estar disponíveis dentro do capô.
Um par de pinças estéreis deve ser usado para remover os ossos colhidos de forma estéril a partir do tubo de microcentrífuga 1,5 ml e colocadas na argamassa; o pilão, então, ser usado para esmagar delicadamente os ossos. Phosphcomeu Buffered Saline é o veículo utilizado para ressuspender os fragmentos ósseos para a injecção. Pipetar 1mL de PBS na argamassa e continuar a esmagar os fragmentos restantes, com movimentos circulares adicionais para garantir a ressuspensão completa. Em seguida, adicione outro 1mL de PBS e continuar esmagando para criar a "solução osso '. A solução deve ter uma tonalidade rosa, e não haverá vestígios deixados no fundo do morteiro que não podem ser totalmente quebrada. Lentamente, deitar a solução para fora da argamassa no tubo 8ml, para pegar o máximo de volume, assegurando os restos maiores ficam para trás no almofariz. Esta solução óssea devem permanecer em gelo até o seu uso experimental e será transferido para seringas de 1ml para injeção. A agulha de calibre Twenty ser posteriormente anexado à seringa contendo 1 mL da solução de ossos, a fim de administrá-lo para o mouse. Este tamanho grande agulha foi escolhido para garantir que todos os fragmentos ósseos entrar na região após a injecção e não bloquear a agulha.
Antes da injeção para o destinatário do mouse, uma gota de solução de osso é colocado sobre uma placa de ágar MacConkey para a cultura (incubação por 24-48 horas). Isso é para garantir a esterilidade da solução óssea. O pH da solução óssea também devem ser verificados para garantir um pH neutro.
4. Lesões dos tecidos moles.
Esta lesão de tecido mole é uma lesão por esmagamento bilateral dos membros posteriores. O posicionamento inicial do mouse, com membros posteriores ligeiramente abduzido e rodado lateralmente, ajuda na acessibilidade ao grupo correto de músculos, os flexores do joelho (bíceps femoral, semitendinoso e semimembranoso músculos). A grande hemostat 18 centímetros será usado para executar a lesão por esmagamento. A distribuição de força destes hemostats aplicada foi analisado e encontrado para ser 270psi usando o Sistema de Análise Topaq pressão por produtos Sensor Inc. O hemostat devem ser fixadas em torno da musculatura posterior da coxa, ponto médio ao longo do fêmur, com sua curva convexa de frente para o fêmur. O hemostat deve então ser trancada e fechada para o primeiro clique só, e permanecer por 30 segundos. Atenção à colocação deste hemostat é importante - não deve ser fixada sobre o fêmur, para garantir que não está rachado. Isso é deve ser realizada de uma forma consistente de cada vez para garantir uma lesão reprodutíveis entre camundongos. Esta lesão por esmagamento é realizada em ambas as extremidades inferiores.
5. Injeção de solução de osso.
O mouse destinatário experimentais serão anestesiados e preparados conforme descrito anteriormente, e foram submetidos a lesão de tecidos moles antes desta injeção óssea.
A solução será, então, osso injetado na musculatura da coxa esmagada do mouse destinatário bilateralmente. Usando uma agulha de calibre 20, 0.15mL desta solução será injetada na musculatura posterior de cada coxa. Digite a agulha através da pele cerca de 2 ~ 3mm e prestar atenção à distância de inserção da agulha - você vai se sentir como a ponta do bisel apenas toca contra o fêmur, esta posição é ideal. Injectar a solução osso agora. Retire a agulha e colocar rapidamente um dedo com luvas estéreis no local da injecção para evitar qualquer refluxo da solução do osso para fora da ferida. Mantenha este dedo ali durante vários segundos.
O mouse será colocado de volta na gaiola e permitiu total liberdade de circulação diretamente como subsídios anestesia. Manejo da dor apropriado deve ser administrado como o mouse desperta.
6. Post-operative/recovery período.
A fita de laço solto é removido e os animais são colocados em uma gaiola limpa, que é mantido em uma almofada de aquecimento circulando para recuperação de várias horas após. Calor deve ser devidamente assegurada com uma lâmpada de calor adicional se necessário.
Alimentos e água será prontamente disponíveis.
Analgésico deve ser administrado como os animais começam a acordar da anestesia, a fim de gerenciar corretamente a dor. Buprenorfina (0.1mg/Kg) é injetado por via subcutânea, os animais começam a atividade física, mas não antes, de modo a não comprometer a função respiratória.
Camundongos devem ser constantemente monitorados durante a anestesia, até que a recuperação da anestesia ou ponto de extremidade experimental. Ratos deve ser também ser muito cuidadosamente monitorizados no pós-operatório e qualquer medicação para a dor adicional necessária deve ser administrada, conforme necessário. Monitorar a atividade física dos animais, estado respiratório, alimentos e água de admissão e quaisquer sinais de angústia (dificuldade respiratória, dor, alterações nos hábitos de comer e beber) deve ser tratada.
Coloque seus instrumentos cirúrgicos em álcool 70% e limpe-os com gaze esterilizada, em seguida, colocá-los para dentro do esterilizador microbead para ~ 20 segundos para esterilização entre os animais. Remover os instrumentos cirúrgicos e pulverizá-los com álcool 70% para ajudá-los a se refrescar. Colocá-los para o sterile vestir campo. Certifique-se que não há álcool deixou sobre os instrumentos que vai pingar de volta para os animais que vem.
3. Modelo de Fratura Bilateral comparativa Fêmur - Procedimentos Experimentais:
O rato experimental serão anestesiados e preparados como descrito inicialmente. A grande hemostat 18 centímetros deve ser fixada ao redor do membro posterior de aproximadamente 2-3mm acima da articulação do joelho com sua superfície convexa de frente para o joelho. Coloque o seu polegar em cima do hemostat preso e seu dedo indicador entre o hemostat e quadril. Certifique-se de sentir o fêmur antes de torcer para que você saiba onde você está quebrando. Então hemostat torção para a esquerda, enquanto a outra mão torção no sentido horário.
Repita o procedimento com a perna contralateral.
4. Modelo Trauma múltiplas - Procedimento Experimental para a Combinação de Pseudofracture com choque hemorrágico:
Rato destinatário será anestesiado e preparado como descrito inicialmente. Camundongos que devam ser submetidos a choque hemorrágico, em combinação com pseudo-fratura terá canulação da artéria femoral antes do procedimento pseudofracture e depois será hemorragia deste cateter uma vez que o pseudo-fratura foi concluída.
5. Segredos para o sucesso:
Geral:
- Certifique-se de fazer o esforço extra para permanecer tão estéril quanto possível.
- Atenção meticulosa deve ser dada à condição geral fisiológica do mouse, incluindo freqüência respiratória, durante a administração de anestesia e particularmente o isoflurano através do cone do nariz.
Preparação da solução óssea:
- Manipulação delicada dos ossos - como pode ser facilmente fraturados com o excesso de esforço durante a manipulação manual simples!
- Fíbula remoção da tíbia deve ser assegurada aos cortes.
- Comece por esmagar ossos delicadamente no início - de forma a manter todos os fragmentos dentro da argamassa!
- Adicionar apenas 1 mL PBS inicialmente e continuar esmagando os fragmentos ósseos remanescentes, uma vez por boa suspensão formou, adicione o restante 1mL.
- Apenas a solução do pilão devem ser recolhidos - sem os tecidos maiores remanescentes que não puderam ser totalmente dividido - estes podem ser bloco / ficar alojado na agulha após a injecção para o mouse destinatário.
Lesões dos tecidos moles:
- Colocação cuidadosa deste hemostat é importante - não sobre o fêmur, ou seria fraturada. Prender o hemostat sobre a musculatura correta (posterior da coxa - flexores do joelho) por danos reprodutível.
Injeção de solução de osso:
- Ao injetar a solução, preste atenção a distância da inserção da agulha - você vai se sentir como a ponta do bisel apenas toca contra o fêmur, esta posição é ideal.
- Retire a agulha e colocar rapidamente um dedo sobre o local da injeção para evitar qualquer refluxo da solução do osso para fora da ferida. Mantenha o dedo lá por alguns segundos.
6. Preocupações pós operativo:
- Verifique se há infecção na perna.
- Verifique cultura solução óssea.
- Animal pode ter problemas ao usar as patas traseiras, como resultado de manipulação experimental e inflamação associadas. Controlar a dor de forma adequada.
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Discussion
Pseudofracture, um modelo reprodutível murino de trauma músculo-esquelético estéril, permite a avaliação da pós-traumático respostas imunes. O modelo pseudofracture imunologicamente imita um ambiente fratura extremidade por meio de recreação das características de uma fratura de ossos longos: músculo lesionado e tecidos moles são expostos a danos no osso e da medula óssea sem quebrar o osso nativo 38,39 Uma resposta bifásica imunológico pode ser visto a seguir. trauma pseudofracture que consiste em uma resposta rápida hyperinflammatory que pode ser visto a pico em 6 horas, seguido de um segundo componente de imunossupressão atrasada descrito como uma calha em torno de 48 horas. Este modelo ajuda a superar alguns dos desafios da modelagem experimental murino trauma, como fraturas de fixação, que pode ser complexa e não é facilmente reproduzível. Em particular, este modelo permite estudar prazo de tarde pós-traumático respostas imunes, uma vez que permite a sobrevivência a longo prazo nos animais sem fratura do osso nativo.
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Disclosures
Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela Institutional Animal Care e do Comitê Use e realizar pesquisas e Compliance Office, da Universidade de Pittsburgh, uma instituição AALAS / AAALAC credenciados. Fontes animais incluem o Jackson Laboratories e Charles Rivers Laboratories. Todos os animais submetidos a garantia de saúde extensivo através de cada fornecedor, bem como a Universidade de Pittsburgh interna do animal programas de monitoramento de saúde. Esta pesquisa é conduzida em conformidade com os princípios do governo dos EUA para o uso de animais vertebrados. O programa está registrado com o USDA, e tem uma carta de garantia com o Gabinete de Serviço de Saúde Pública do Laboratório de Bem-Estar Animal.
Acknowledgments
Biologia financiamento Source / Número Molecular de choque hemorrágico GM053789
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical blue pad | Fisher Scientific | 50-7105 | |
| Sterile Field dressings | Fisher Scientific | NC9517505 | |
| Circulating heating pad 18"x26" | Harvard Apparatus | py872-5272 | |
| Hot bead instrument sterilizer | VWR international | 11156-002 | |
| Stainless steel tray 8" x 11" | VWR international | 62687-049 | |
| Plexiglass boards (10x15x0.5cm) | University of Pittsburgh Machine shop | ||
| Tape rolls 1" | Corporate Express | MMM26001 | |
| 50cc conical tube | Any Supplier | ||
| Straight side wide mouth jars (used as cap for nose cone) | VWR international | 159000-058 | |
| Oster A5 clippers w. size 40 blade | VWR international | 10749-020 | |
| Surgical scissors (straight – 12cm) | Fine Science Tools | 14068-12 | |
| Hemostats curved -18cm | Harvard Apparatus | 81331718 | |
| Forceps (0.8mm-tip, curved-10cm) | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Gauze 4"x4" | Any Supplier | ||
| 1.5cc microfuge tube | Any Supplier | ||
| Ice bucket | Any Supplier | ||
| Mortar and Pestle | Fisher Scientific | 12-961AA | |
| 1cc syringe w/ 25G needle | Fisher Scientific | 14-826-88 | |
| 20G needle | Any Supplier | ||
| 1mL pipetteman | Any Supplier | ||
| 1mL pipette tips | Any Supplier | ||
| Falcon polystyrene 8ml tubes | VWR international | 60819-331 | |
| Sterilization pouch 3"x8" | VWR international | 24008 | |
| Sterilization pouch 5"x10" | VWR international | 24010 | |
| MacConkey II Agar plate | BD Biosciences | 221172 | |
| Ethyl Alcohol - 200 proof | Pharmco-AAPER | [70%] | |
| Pentobarbital Sodium (Nembutol Sodium Solution) | OVATION Pharmaceuticals | 70mg/kg | |
| Aerrane (Isoflurane) | Baxter Internationl Inc. | 99.9% | |
| Triadine Povidone Iodine (Betadine) | Triad disposables | ||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | |||
| Buprenorphine HCl | Bedford Laboratories | 0.1mg/kg |
References
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