Summary
이 프로토콜은 세포 내에서 활성 RhoC GTPase의 수준을 결정하기 위해 분석 아래로 끌어을 활용합니다.
Abstract
RhoC GTPase RhoA GTPase가에 91%의 상동 있습니다. 때문에 세포에 그 유행의 RhoA GTPase 많은 시약 및 기술이 개발되었습니다. 그러나, RhoC GTPase는 상대적으로 낮은 수준에서 전이성 암세포에 표시됩니다. 따라서, 몇 가지 RhoC 특정 시약이 개발되었습니다. 우리는 RhoC GTPase를 감지 Rho 활성화 분석을 적응있다. 이 기술은 활성 RhoC의 GTPase를 빼내 GST - Rho 바인딩 도메인 융합 단백질을 활용합니다. 또한, 우리는 전체의 수준 (GTP와 GDP 바운드) RhoC의 GTPase을 결정하기 위해 분석의 시작 부분에서 총 단백질을 수확 수 있습니다. 이것은 세포에 적극적으로 대 총 RhoC GTPase의 결정을 허용합니다. 이 절차의 여러 상업적인 버전은 그러나 개발되었습니다, 상업 키트 RhoA GTPase에 최적화되어 있으며, 일반적으로 RhoC GTPase를 위해 잘 작동하지 않습니다. 분석의 부품은 RhoC 특정 항체의 개발뿐만 아니라 수정되었습니다.
Protocol
1. 준비 GST - 융합 단백질
- BamH1/EcoR1 pGEX3x 벡터로 subcloned rhotekin Rho 구속력을 도메인 (RBD)의 첫 번째 N - 터미널 90 아미노산을 포함하는 JM109 관할 세균의 글리세롤 주식이 만들어집니다.
고효율을 보장하기 위해 다음 단계는 각 실험에 대해 수행되어야합니다. 우리의 경험에서 갓 GST - RBD는 강력하고 정확한 GTPase 활성화 분석의 열쇠입니다 준비. - LB의 A 50 ML에 글리세롤 주식의 (대략, 해동하지 않음) 50 μL 추가 잡고 37 ° C 하룻밤 성장.
- 500 ML LB - A에 1시 10분을 희석 1 H.위한 성장
- 2 시간에 대한 IPTG 0.1 밀리미터와 GST 단백질 생산을 유도.
- 5000에서 원심 분리기 병 및 원심 분리기, Sorval GSA3 로터에 균일하게 배포 RPM 4 ° C 20 분.
- 원심 분리기 병에 Resuspend 펠렛, 용해 완충액 10 ML *.
* 박테리아 용해 완충액 : 20 % 자당, 10 % 글리세롤, 50 MM 트리스 산도 8.0, 0.2 MM 2 S 2 O 5, 2 MM MgCl 2, 2 MM의 DTT 나는 신선한 PMSF, benzamide, aprotinin과 류펩틴을 추가합니다. - 2-3 분 (이 sonicator의 종류에 따라 다릅니다. 우리는 마르크 6 세트 피셔 소닉 Dismembranator 모델 500, 50 %의 사이클을 사용) Sonicate.
- 4 원심 분리기, Sorvall SS34, 20 분 10,000 RPM ° C. 이 시점에서 작은 나누어지는는 제거 할 수 있습니다 SDS - PAGE에 의해 실행합니다. 겔은 쿠매시 자국이있을 수 있으며, 밴드 46 KDA에서 명확해야합니다.
- 뜨는 제거 50 % glutatione - 세파 로스 4B 슬러리 1 ML를 추가합니다.
- 4 30 분 품어 ° C를 회전. 용해 완충액 3 번 씻으십시오.
- GST - 생선 버퍼와 50 %의 슬러리 (약 1 ML)로 GST-RBD/glutatione-Sepharose 비즈를 Resuspend **. ** GST - 피시 버퍼 : 10 % 글리세롤, 50 MM 트리스 산도 7.4, 100 MM NaCl는, 1 % NP - 4, 2 MM MgCl 2, 신선한 PMSF, benzamide, aprotinin과 류펩틴 추가
2. GST - 융합은 분석을 내리다
- 50-10 X 10 6 세포 / 분석을 사용
- 일단 얼음 차가운 PBS에서 얼음에 접시를 유지 (우리가 얼음 가득한 평면 유리 접시를 사용)와 0.5 ML GST - 물고기 버퍼 lyse 세포를 씻으십시오.
- 얼음에 5 분 품어, 고무 경찰이나 평면 scrapper를 사용하여 수확 세포는 튜브를 microfuge 4에서 20,000 RPM 5 분 원심 분리기로 전송 ° C.
- 신선한 microfuge 튜브에 뜨는 전송합니다. 총 Rho (예 : GDP + GTP 바운드) 결정 50 μL를 가져가라.
- 0.5 ML의 GST-RBD/glutatione-Sepharose 비즈를 추가하고 4 회전 하룻밤 ° C, 알을 품다.
- GST - 생선 버퍼와 배의 씻으십시오.
- 40 μL 2X - Laemelli 샘플 버퍼에 Resuspend 비즈
이 시점에서 2.4 촬영한 총 Rho 단백질 나누어지는의 농도는 결정 30 μg는 해당 인증 샘플로 젤에서 실행할 수 있도록 준비한다. - 종기 샘플은 90 ° C에서 5 분, 짧게 원심 분리기 및 뜨는 (예 : 구슬을 피하) 부하를 가지고 12 잘 40~20% 기울기 SDS - PAGE 젤에서 실행됩니다.
- 100 W.의 Towbin 버퍼와 상수가 현재 사용하는 멤브레인로 전송, 아니 높은 150 볼트에서 젤을 실행
- RhoC - specfic 항체와 함께 5 % 우유 / TBST 솔루션과 프로브와 멤브레인를 차단합니다.
3. 대표 결과
좋은 결과는 약 22 KDA에서 단일 밴드를 생산한다. 나쁜 결과는 여러 개의 밴드 혹은 높은 배경을 생산하고 있습니다. 이것은 단백질 저하, 샘플 불완전 세척 또는 오래된 GST - RBD의 사용을 나타내는 것입니다.
그림 1. RhoC GTPase의 다른 레벨을 표현하는 세 가지 세포 라인은 활성 및 총 RhoC 활성 및 총 RhoC 높은 수준의 여부 RhoC의 낮은 수준을 보여주는 표시됩니다. 얼룩 그런 다음 옷을 벗긴 채 총 RhoC 단백질에 대한로드 컨트롤 역할을하는 집 지키는 유전자 굴지으로 항체와 reprobed했다.
그림 2. 여러 밴드 또는 단백질 저하, 샘플의 불완전한 세척 또는 오래된 GST - RBD의 사용으로 높은 배경 결과입니다.
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Discussion
절차의 가장 중요한 단계는 신선한 GST - RBD의 생성이다. 이 단계에주의하지 않으면 실패에 대한 주요 이유입니다. GST - RBD (1.2)의 세대에서 세포 lysate (2.5)와 함께 밤새 배양하기위한 모든 단계는, 하루에 수행되어야합니다. 또 다른 중요한 단계는 세포 lysates을 생산하기에 충분한 세포가있다는 것을 확실하게하는 것입니다. 세포의 낮은 수준에 존재하는 경향이 RhoC GTPase에서 볼 때 이것은 특히 중요하다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
국방학과 W81XWH - 05 - 1-0005, W81XWH - 06 - 1-0495, W81XWH - 08 - 1-0029 및 W81XWH - 08 - 1-0356
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gluthione-sepharose 4B beads | GE Healthcare | 17-0756-01 | |
| Criterion 4-20% Tris-HCl gels | Bio-Rad | 345-0032 |
References
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