Summary
Detta protokoll beskriver isolering, anrikning och underhåll av stamceller medulloblastom tumörceller från muterade möss med ektopisk Sonic Hedgehog pathway aktivitet.
Abstract
Hjärntumörer har föreslagits att äga en liten population av stamceller som är den grundläggande orsaken till Tumörgenesens. Neurosphere analyser har allmänt antagits att studera vilken typ av neurala stamceller, även sådana som härrör från normal och tumörform vävnader. Men betydande mängder av differentiering och celldöd är vanliga i odlade neurospheres sannolikt på grund av suboptimala tillstånd som tillgänglighet för alla celler inom sfären aggregat till kultur medium.
Medulloblastom, den vanligaste barn CNS-tumör, kännetecknas av snabb utveckling och tendens att sprida sig längs hela hjärnan spinal axeln med dystra kliniskt utfall. Medulloblastom är en neuroepiteliala tumör i lillhjärnan, som står för 20% och 40% av intrakraniell och bakre fossa tumör i barndomen, respektive 1. Det är nu väletablerat att Shh signalering stimulerar spridningen av cerebellär prekursorer granulat neuron (CGNPs) under cerebellär utveckling 2-4. Ett flertal studier med hjälp av musmodeller, där Shh vägen är konstitutivt aktiverad, har kopplat Shh signalering med medulloblastom 5-9.
En färsk rapport visar att en delmängd av medulloblastom celler från Patched1 LacZ / + möss är cancer stamceller, som kan initiera och uppförökningsmaterial tumörer 10. Här beskriver vi en effektiv metod att isolera, berika och underhålla tumör stamceller från olika musmodeller av medulloblastom, med konstitutivt aktiverad Shh väg på grund av en mutation i Smoothened (11, härefter kallat SmoM2), en GPCR som är avgörande för Shh väg aktivering. I varje isolerat medulloblastom vävnad, kunde vi etablera ett flertal mycket proliferativ kolonier. Dessa celler kraftfullt uttryckte flera neurala markörer stamceller som nestin och Sox2 kan genomgå seriella passager (större än 20) och var klonogena. Även om dessa odlade tumör stamceller var relativt små, ofta bipoar med hög nukleär cytoplasmisk förhållande vid odling under förhållanden som gynnar tillväxt stamceller, ändras de dramatiskt sin morfologi, utökad flera cellulära processer, tillplattad och drog sig ur cellcykeln vid övergång till en cell odlingsmedium kompletteras med 10% fetalt bovint serum. Ännu viktigare är att dessa tumörer stamceller differentieras till Tuj1 + eller Neun + nervceller, GFAP + astrocyter och CNPase + oligodendrocyter, vilket understryker deras multi-potens. Dessutom var dessa celler kan sprida sekundära medulloblastomas när orthotopically transplanteras i värd möss.
Protocol
1. Micro-dissekering av tumör-bärande lillhjärnan, Dissociation av tumörvävnad och plätering
- Hämtning av tumörvävnad
- Sjuka möss med medulloblastom ofta var runted, visas hydrocefalus och typiska neurologiska symtom, inklusive bakre förlamning och oförmåga att återfå ställning när välte. För att hämta tumörvävnad, euthanize möss med koldioxid inandning. Det är viktigt att inte utföra halsdislokation, ett förfarande som genererar trycket till den bakre skallen och kan äventyra tumörvävnad integritet.
- Halshuggning sker omedelbart efter döden med hjälp av en sax, ta bort hår och muskelvävnad så mycket som möjligt för god visualisering av skallen. Rengör ytan av skallen med Kimwipe indränkt med 95% etanol.
- Använd fin sax för att klippa en öppning längs mittlinjen av skallen och ta bort skallen vävnad med hjälp av fin pincett, då hela hjärnan, inklusive tumör-bärande lillhjärnan är utsatt för.
- Medan cerebella av friska vuxna visa väldefinierade halvklot och vermis, den cerebella av tumör-bärande möss är ofta förstorad, amorft med slät yta och iögonfallande blodkärl. Använda sterila tekniker, hämta lillhjärnan tumören med hjälp av pincett och lägg i iskallt PBS utan Mg 2 + och Ca 2 +.
Obs: alla instrument är steriliserade i 95% etanol före användning. - Dissociation av tumörvävnad
- Överför tumörvävnad från PBS till 50% Accutase (som spätts i PBS) som är ca 4 gånger volymen av tumörvävnad, finhacka vävnaden med fina sax i 3 minuter vid rumstemperatur, följt av inkubering vid 37 ° C i 4 minuter , varefter vävnaden genomgår återkommande pipeting med en 1-ml Pipetman för ytterligare 3 minuter. Denna metod bör ge en blandning av enskilda celler och små mobila aggregat.
- Späd cellulära fjädring 3-faldigt med PBS och centrifugera i 5 minuter vid 1000 g till pellets cellerna. Resuspendera cellpelleten i färskt neurala stamceller odlingsmedium och tallrik på en gelatiniserad 60 mm primaria vävnadskultur maträtt. Vi använder primaria rätter för förbättrad infästning vid första bordläggning, därefter passager kan vara klädd på vanliga rätter vävnadskultur.
Obs: Coat kultur rätter med 0,1% gelatin i minst 30 minuter. Bered en färsk neurala stamceller cellkulturens medium bestående av Neurobasal medium med glutamin, Pen-Strep, N2, B27, mänskliga EGF (25 ng / ml) och grundläggande FGF (25ng / ml).
2. Anrikning, underhåll och utbyggnad av celler medulloblastom Tumör av Serial Passages
Vi får ofta många kolonier efter 1 veckas initial bordläggning (figur 1). Dessa kolonier kan skiljas och replated till nya gelatiniserad rätter för anrikning av tumörcellen befolkningen. Först byta till nya odlingsmedium, sedan helt enkelt använda en 1-ml Pipetman att mekaniskt koppla kolonier följt av repetitiva pipeting i 4 minuter för att ge en cellulär suspension (ingen Accutase behövs). Kontrollera i mikroskop för att se till att stora cellen klumpar har dissocierade. Sedan avstå cellsuspension till nya gelatiniserad rätter för ytterligare odling och gå igenom samma procedur för ytterligare passager. Obunden tumörceller, blodkroppar och andra typer av celler avlägsnas genom seriell åter ytbehandlingar, lämnar bifogade tumörcellerna att expandera snabbt. Ändra odlingsmedium den andra dagen efter initial seeding, och varannan dag därefter.
3. Immunofluorescens färgning och undersökning av odlade celler
1. Odla tumörceller på glas täckglas
Dag 1, placera ett glas täckglas i varje en 6-brunnar, lägg sedan till 0,1% gelatin i 30 minuter vid 37 ° C. Seed cirka 2-4X 10 5 tumörceller per ml. Cellerna bör fästa över natten och de neurala stamceller medelstora förändrats på dag 3. Färgning sker på dag 4.
2 immunofluorescens färgning
Ta bort odlingsmedium och celler tvätta två gånger med iskall PBS. Fixera cellerna med nygjord 4% PFA i 15 minuter. Kortfattat tvätta cellerna två gånger med PBS och permeablize med 0,3% Triton (i PBS) i 5 minuter. Kortfattat tvätta cellerna två gånger med PBS och block med 10% get serum i 40 minuter. Inkubera cellerna med primära antikroppen i 90 minuter, tvätta sedan celler tre gånger med PBS, i 5 minuter vardera. Inkubera cellerna med sekundär antikropp i 60 minuter, tvätta sedan tre gånger med PBS, 5 minuter vardera. Mount täckglas på bilder med 5 ml av en vattenlösning monteringsmedium och utföra konfokalmikroskopi.
4. Differentiering av tumörceller
Ta bort neural stamceller medellång och kort tvätta cellerna med PBS två gånger. Lägg differentiering medium på dag 1, byta medium på dag 4 och bestämma nivån av differentiering av immunofluorescens färgning på dag 7. Differentieringen mediet består av DMEM, Pen-STREP och 10% fetalt bovint serum.
5. Representativa resultat
Morfologi resultat
Efter Accutase behandling och skonsam repetitiva pipeting bör tumörvävnad vara mest dissocierade i små mobila aggregat och enskilda celler. Många betydande kolonier kan observeras så tidigt som 5 dagar efter första plätering, vilket framgår av Figur 1. Mycket proliferativ tumörceller ofta bipolära med hög kärn / cytoplasmiska förhållande. Dessa celler ses vanligtvis som strålar ut från små mobila aggregat bifogas gelatiniserad ytan. Blodkroppar, små och runda, vanligen bort av efterföljande medier förändringar och seriell ytbehandlingar. Efter flera passager, kan man observera jämnt fördelad, proliferativ Ki67 + tumörceller och lite kontaminering med andra celltyper (Figur 2).
Redovisning av neurala markörer stamceller, klonal analys och differentiering i flera linjer
För att avgöra om proliferativ celler från dissocierade cerebellär visa tumören egenskaper tumör stamceller genomförde vi ytterligare karakterisering av stamceller markör uttryck, klonal analys och differentiering potens. Vi fann att dessa isolerade tumörceller högt uttrycka neurala markörer stamceller som Sox2 och nestin (Figur 3). Som vi vävnaderna från SmoM2-YFP tumör, alla tumörceller uttrycka YFP. I överensstämmelse med en nyligen genomförd studie rapporterar att det primära cilier är viktiga för utvecklingen av Shh väg-beroende medulloblastom 12, SmoM2-YFP uttryck var klart lokaliserad till flimmerhåren i Sox2 + tumörceller (Figur 3). När pläterade på klonal täthet av 300 celler per ml odlingsmedium, konstaterade vi klonal expansion från en enda tumör cell till en betydande koloni (Figur 4). Dessutom var dessa celler kan skilja i olika nervceller och gliaceller celltyper vid odling i pro-differentiering förhållanden (Figur 5).
Figur 1. Morfologi av en mycket proliferativ koloni efter första plätering av dissocierade medulloblastom vävnad. Generellt finns en stor koloni former inom 5 dagar efter den första sådd av dissocierade tumörvävnad, och en företrädare som visas här i ljusa fält. Bipolära, avlånga celler utstrålar från en tät kärna cell aggregat. Bifogat till tumörceller är små, runda röda blodkroppar, som gradvis är uttömda av seriell ytbehandlingar.
Figur 2. Morfologi av etablerade medulloblastom celler än tre passager. Detta ljusa fältet Bilden visar typiskt utseende av etablerade medulloblastom celler efter flera passager. Cellerna fortfarande främst bipolära med hög kärn / cytoplasmiska förhållande. Vi visar acetylerade tubulin färgning av tumörceller, varav de flesta cyklar som framgår av starka Ki67 uttryck.
Figur 3. Etablerade medulloblastom celler uttrycka neurala markörer stamceller. SmoM2-YFP markerar celler som uttrycker konstitutivt aktiv SMO, därav Shh väg aktivitet. Alla celler av de etablerade linjerna medulloblastom cellen uttryckte YFP, och de flesta co-uttrycks höga nivåer av olika neurala markörer stamceller, som nestin och Sox2. Intressant, när vi utfört YFP signal upptäckt med minimal lasereffekt under konfokalmikroskopi upptäckte vi koncentrerat YFP signal i flimmerhåren i Sox2 + celler. Denna observation är förenlig med en färsk rapport 12 som beskrev viktiga roll flimmerhår i utvecklingen av Shh väg-beroende medulloblastom.
Figur 4. Etablerade tumörceller genomgå klonal expansion. Efter avståndstagande till en enda cellsuspension var tumörceller pläterad på en 24 väl plåt, på klonal täthet av 300 celler per ml odlingsmedium. I varje väl vi observerade kloner expanderat kolonier. Denna serie av ljusa fält bilder visar typiska förändringar över en 10-dagarsperiod av kultur.
Figur 5. Differentiering analyser av etablerade medulloblastom celler. När tumörceller har bytt från fonden / bFGF innehåller serumfritt medellång till DMEM/10% FBS, YFP + tumörceller signifikant förändrade deras morfologi och differentieras till olika celltyper, IncLuding Tuj1 + eller Neun + nervceller, GFAP + astroglial celler eller CNPase + oligodendrocyter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver ett effektivt sätt att isolera, berika och underhålla celler medulloblastom härrör från primära tumören hämtas från muterade möss med konstitutivt aktiv Hedgehog-signalering. Vi fann att ett kritiskt steg i ett framgångsrikt införande av ett hälsosamt tumör stamcellslinje är Accutase behandling som används vid dissociation av den primära tumören vävnad. Vår erfarenhet är att när de först ta avstånd tumörvävnad från lillhjärnan, 4 minuter på 50% Accutase behandling vid 37 ° C, följt av 3 minuter av repetitiva pipeting med en 1-ml Pipetman kommer i allmänhet att resultera i lyckad första sådd. Det är också viktigt att vänta tills betydande kolonier bildas innan de plating (Figur 1). Efter den första sådd är Accutase behandling inte längre är nödvändigt, repetitiva pipeting i 3-4 minuter med en 1-ml Pipetman är tillräckligt för att rubba och separera celler klumpar för ny-plating. Använd inte mindre volym Pipetman som finare tips kan skada cellerna i stor utsträckning. En etablerad cellinje kan genereras från varje isolerade tumörvävnad och dessa celler är mycket proliferativ, kraftfullt uttryck för flera neurala markörer stamceller och kan differentiera till både nervceller och gliaceller celltyper. Vi har utfört orthotopic transplantation av dessa celler i immuno äventyras-mottagare möss som senare utvecklades sekundärt medulloblastomas. Dessa tumörceller i kultur ställde sällan spontan differentiering eller apoptos, funktioner som är gemensamma för neurosphere kultur metoder. Detta protokoll är utformad för en framgångsrik spridning av tumör stamceller från primär medulloblastomas och därmed gör det möjligt att testa effekterna av gener och hämmare kemiskt på Hedgehog-driven tumörcellen tillväxt och beteende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Denna studie har finansierats med bidrag från Vanderbilt-Ingram Cancer Center Support Grant (P30 CA068485) Childhood hjärntumör Foundation och National Institutes of Health (NS042205).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| hEGF | Invitrogen | PHG0311 | 25ng/ml |
| bFGF | Invitrogen | PHG0023 | 25ng/ml |
| N2 | Invitrogen | 17502048 | 1X |
| B27(-RA) | Invitrogen | 12587010 | 1X |
| Accutase | Invitrogen | A1110501 | 50% |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1393 | 0.1% |
| Glutamine | Invitrogen | 25030081 | 2mM |
| Primaria dishes | Fisher Scientific | 087724C | |
| Sox2 antibody | EMD Millipore | MAB4343 | Mouse, 1:1000 |
| Nestin antibody | DSHB | rat401 | Mouse, 1:200 |
| YFP antibody | Molecular Probes, Life Technologies | A11122 | Rabbit, 1:2000 |
| GFAP antibody | Neuromics | CH22102 | Chicken, 1:1000 |
| Tuj1 antibody | Sigma-Aldrich | T5076 | Mouse, 1:2000 |
| NeuN antibody | EMD Millipore | MAB377 | Mouse, 1:2000 |
| CNPase antibody | EMD Millipore | MAB326 | Mouse, 1:1000 |
References
- Rossi, A., Caracciolo, V., Russo, G. Medulloblastoma: From Molecular Pathology to Therapy. Clin Cancer Res. 14 (4), 971-971 (2008).
- Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. Control of Neuronal Precursor Proliferation in the Cerebellum by Sonic Hedgehog. P. Neuron. 22 (1), 103-103 (1999).
- Dahmane, N., Ruiz, A., Altaba, I. Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126 (14), 3089-3089 (1999).
- Wallace, V. A. Purkinje-cell-derived Sonic hedgehog regulates granule neuron precursor cell proliferation in the developing mouse cerebellum. Curr Biol. 9 (8), 445-445 (1999).
- Fan, X., Eberhart, C. G. Medullablastoma Stem Cells. J Clin Oncol. 26 (17), 2821-2821 (2008).
- Yoon, J. W., Gilbertson, R., Iannaccone, S. Defining a Role for Hedgehog Pathway Activation in Desmoplastic Medulloblastoma by Identifying GLI1 Target Genes. International journal of cancer. 124 (1), 109-109 (2009).
- O'Dorisio, M. S., Khanna, G., Bushnell, D. Combining anatomic and molecularly targeted imaging in the diagnosis and surveillance of embryonal tumors of the nervous and endocrine systems in children. Review. Cancer metastasis reviews. 27 (4), 665-665 (2008).
- Corcoran, R. B., Bachar Raveh, T., Barakat, M. T. Insulin-like Growth Factor 2 Is Required for Progression to Advanced Medulloblastoma in patched1 Heterozygous Mice. Cancer research. 68 (21), 8788-8788 (2008).
- Gilbertson, R. J., Ellison, D. W. The Origins of Medulloblastoma Subtypes. Annual review of pathology. 3, 341-341 (2008).
- Ward, R. J., Lee, L., Graham, K. Multipotent CD15+ Cancer Stem Cells in Patched-1 Deficient Mouse Medulloblastoma. Cancer research. 69 (11), 4682-4682 (2009).
- Mao, J., Ligon, K. L., Rakhlin, E. Y. A Novel Somatic Mouse Model to Survey Tumorigenic Potential Applied to the Hedgehog Pathway. Cancer research. 66, 10171-10171 (2006).
- Han, Y. G., Kim, H. J., Dlugosz, A. A. Dual and opposing roles of primary cilia in medulloblastoma development. Nature medicine. 15 (9), 1062-1062 (2009).
