Summary
Toxoplasma gondii पर्यावरण तनाव, जो टिशू कल्चर मॉडल में मजाक उड़ाया जा सकता है के जवाब में एक पुटी के रूप में धर्मान्तरित. यह वीडियो तकनीक दर्शाता है कि अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज सक्रिय या विकास fibroblast कोशिकाओं में मध्यम पीएच बदलने पुटी दीवार गठन की जांच करने के लिए.
Abstract
Toxoplasma gondii एक लाचार intracellular परजीवी है कि आतशमिज़ाज पशुओं के किसी भी nucleated सेल आक्रमण कर सकते है. संक्रमण के दौरान, टी. gondii प्रसार के रूप में एक तेजी से नकल फार्म tachyzoite बुलाया. Tachyzoites एक धीमी गति से बढ़ रही encysted एक संकेत प्रक्रिया है कि अच्छी तरह से नहीं विशेषता है द्वारा bradyzoite बुलाया रूप में परिवर्तित. पशुओं के भीतर, bradyzoite अल्सर केंद्रीय तंत्रिका तंत्र और मांसपेशियों के ऊतकों में पाया जाता है और संक्रमण के जीर्ण अवस्था का प्रतिनिधित्व करते हैं. Bradyzoites रूपांतरण टिशू कल्चर में सीओ 2 भुखमरी के द्वारा सिम्युलेटेड किया जा सकता है एक उच्च पीएच, या इंटरफेरॉन गामा (IFNγ) के अलावा के साथ माध्यम का उपयोग कर. Bradyzoites एक पुटी दीवार, जो लेक्टिन Dolichos biflorus agglutinin (DBA) बांध की उपस्थिति द्वारा विशेषता है. Fluorescently लेबल DBA मानव चमड़ी (HFFs) fibroblasts है कि कम सीओ 2 और उच्च पीएच मध्यम को उजागर किया गया है में हो परजीवी में पुटी दीवार कल्पना करने के लिए प्रयोग किया जाता है. इसी प्रकार, परजीवी murine अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज (BMMs) में रहने के बाद एक पुटी DBA द्वारा detectable दीवार प्रदर्शित BMMs IFNγ और lipopolysaccharide (LPS) के साथ सक्रिय हैं. इस प्रोटोकॉल का प्रदर्शन कैसे टी. के रूपांतरण उत्पन्न करने के लिए कम सीओ और BMMs के 2 सक्रियण के साथ एक उच्च पीएच मध्यम विकास का उपयोग कर bradyzoites gondii. होस्ट कोशिकाओं coverslips पर सुसंस्कृत हो जाएगा, tachyzoites से संक्रमित और IFNγ और LPS (BMMs) के अलावा के साथ या तो सक्रिय या तीन दिनों के लिए एक उच्च pH वृद्धि मध्यम (HFFs) को उजागर. संक्रमण के पूरा होने पर, मेजबान कोशिकाओं, तय हो जाएगा permeabilized, और अवरुद्ध. पुटी दीवारों प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ rhodamine DBA का उपयोग visualized किया जाएगा.
Protocol
1. मानव चमड़ी (HFF) fibroblasts लेपित coverslips की तैयारी
- 24 अच्छी तरह से एक ऊतक संस्कृति की थाली के कुओं के तल पर एक बाँझ दौर कांच coverslip प्लेस.
- एक मिला हुआ 150cm 2 कुप्पी से HFFs फसल, फ्लास्क दो बार और 1X पीबीएस के साथ कुल्ला 0.025% trypsin - EDTA के 2.5 मिलीलीटर जोड़ने. 37 ° 5-10 मिनट के लिए सी फ्लास्क सेते हैं.
- कुप्पी की ओर अपने हाथ की हथेली के खिलाफ दोहन फ्लास्क कोशिकाओं से detaching में सहायता कर सकते हैं. एक बार कोशिकाओं कुप्पी से जारी है, HFF मध्यम के 150 मिलीलीटर (Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम [DMEM] 10% FBS के साथ, 2 मिमी एल glutamine, और 1% पेनिसिलिन - स्ट्रेप्टोमाइसिन) और मध्यम उपयोग फ्लास्क कुल्ला और जमा जोड़ने कोशिकाओं.
- Coverslips के साथ अच्छी तरह से प्रति कोशिकाओं के 1 मिलीलीटर बग़ैर.
- कोशिकाओं को 37 में मिला हुआ बनने के लिए डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 की अनुमति दें.
2. L929 बीएमसी विकास के लिए वातानुकूलित मध्यम (मुख्यमंत्री) की तैयारी
- L929 एक murine aneuploid fibrosarcoma सेल लाइन है कि बृहतभक्षककोशिका कॉलोनी secretes confluency की लंबी अवधि के बाद उत्तेजक कारक है. यह स्राव L929 करने के लिए सेल संस्कृति में 1 मैक्रोफेज में माउस अस्थि मज्जा की कोशिकाओं को विकसित करने के लिए इस्तेमाल किया जा कोशिकाओं से मुख्यमंत्री सक्षम बनाता है.
- एक बार L929 कोशिकाओं मिला हुआ हैं, उन्हें एक अतिरिक्त 7-9 दिनों के लिए सेते हैं जब तक वे गोलाकार दिखाई देगा और दूर फ्लास्क उठाने शुरू. सतह पर तैरनेवाला और गोली 10 मिनट के लिए 425 XG पर किसी भी अलग कोशिकाओं लीजिए. यह सतह पर तैरनेवाला मुख्यमंत्री है.
- एक और L929 कोशिकाओं के 150 सेमी 2 फ्लास्क मुख्यमंत्री के 30 मिलीलीटर, जो बीएमसी माध्यम के 150 मिलीलीटर उत्पन्न पैदावार . बीएमसी माध्यम से 10% FBS, 20%, मुख्यमंत्री, 1% पेनिसिलिन - स्ट्रेप्टोमाइसिन, और DMEM में 1% एल glutamine से बना है.
3. अस्थि मज्जा और BMCs की सेल संस्कृति के अलगाव
- सीओ 2 asphyxiation और सतह के 70% इथेनॉल के साथ बाँझ से एक माउस / 6 C57BL बलिदान .
- पैर के पास पेट की त्वचा को हटाने और कैंची से काट द्वारा पेरिटोनियम बेनकाब. Peritoneal गुहा puncturing से बचें. पैर के नीचे कट टिबिअ और जांध की हड्डी बेनकाब. पैर कैंची का उपयोग हड्डियों मांसपेशियों के ऊतकों से कट.
- फीमर हटायें, घुटने के नीचे एक बार और एक बार कूल्हे के पास कटौती. एक जीवाणु पेट्री डिश में ठंड 1X पीबीएस युक्त हड्डियों रखें. क्योंकि BMCs स्थायी रूप से पालन करना होगा इन चरणों के लिए ऊतक संस्कृति पेट्री डिश इलाज का उपयोग नहीं करें. एक स्केलपेल प्रयोग के लिए रवाना अतिरिक्त मांसपेशियों के ऊतकों परिमार्जन. अस्थि मज्जा बेनकाब करने के लिए घुटने के ऊपर कट.
- दोहराएँ कदम (ख) और (ग) दूसरे फीमर से अस्थि मज्जा को इकट्ठा करने के लिए.
- एक 10cc ठंड 1X पीबीएस और एक 25 गेज के लिए एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में अस्थि मज्जा बेदखल सुई से भरा सिरिंज का उपयोग करें. हड्डी दिखाई देनी चाहिए शुद्ध सफेद एक बार मज्जा को निकाल दिया जाता है.
- पीबीएस / मज्जा मिश्रण एक 22 गेज सुई के माध्यम से पारित करने के लिए किसी भी अस्थि मज्जा समुच्चय को तोड़ने के लिए.
- 10 मिनट के लिए 425 XG पर मिश्रण स्पिन, और सतह पर तैरनेवाला हटायें.
- बीएमसी माध्यम से 8 मिलीलीटर में गोली Resuspend. 8 जीवाणु पेट्री डिश के लिए सेल निलंबन और 9 मिलीलीटर बीएमसी मध्यम 1 मिलीलीटर जोड़ें.
- 37 में सेते ° सी, 5% सीओ 2.
- 5 दिन पर हर प्लेट 10 मिलीलीटर बीएमसी मध्यम जोड़ें. 7 दिन तक, कोशिकाओं को पूरी तरह विकसित किया जाएगा. BMCs परिपक्वता के बाद 1-2 सप्ताह के लिए passaged हो सकता है.
- BMCs को विभाजित करने के लिए, मध्यम हटाने और प्रत्येक पेट्री डिश ठंड 1X पीबीएस के 5 मिलीलीटर जोड़ें. 4 में सेते ° सी 30 मिनट के लिए, जब तक कोशिकाओं के लिए लिफ्ट शुरू. एक बाँझ हस्तांतरण विंदुक के साथ थाली से BMCs कुल्ला.
- एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब और 10 मिनट के लिए 425 XG पर गोली में BMCs पूल.
- 10 मिलीलीटर बीएमसी मध्यम और एक hemocytometer पर गिनती में गोली Resuspend. बीज 24 अच्छी तरह तल पर गोल कांच coverslips के साथ एक थाली में 2x105 BMCs के प्रति में अच्छी तरह से. टी. के साथ संक्रमण के पहले BMCs रातोंरात पालन अतिरिक्त gondii. BMCs बाद में उपयोग के लिए पेट्री डिश पर reseeded किया जा सकता है.
4. टी. के साथ संक्रमण कोशिकाओं gondii
- 2x10 6 टी. के साथ मिला हुआ HFFs के 25 सेमी 2 फ्लास्क को संक्रमित gondii और बढ़ने जब तक कोशिकाओं lyse शुरू (2-3 दिनों के बारे में).
- एक सेल खुरचनी का उपयोग करने के लिए टिशू कल्चर कुप्पी से संक्रमित मेजबान सेल monolayer हटायें तो एक 27 गेज सुई के माध्यम से उखाड़ फेंकना monolayer गुजर द्वारा मेजबान कोशिकाओं से परजीवी जारी है.
- मध्यम में परजीवी की संख्या का निर्धारण एक hemocytometer का प्रयोग करें.
- HFF monolayers के 1 प्रोटोकॉल, या प्रोटोकॉल 3 से BMCs से coverslip के साथ अच्छी तरह से प्रति 10 5 परजीवी संक्रमित . परजीवी 37 पर 3 घंटे के लिए आक्रमण ° सी, 5% सीओ 2.
5. टी. की शुरुआत gondii पर्यावरण तनाव से bradyzoite विकास
- Bradyzoite विकास HFFs में मध्यम पीएच वृद्धि हुई है और सीओ 2 भुखमरी के साथ
- विकास मध्यम तैयार. विकास मध्यम RPM को शामिलमैं बिकारबोनिट के बिना 1640, 1% FBS, 1% पेनिसिलिन - स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 42 मिमी HEPES. 8.0 पीएच और फिल्टर बाँझ.
- संक्रमित HFFs से DMEM निकालें, 1X पीबीएस से कुल्ला, और विकास के माध्यम से 1ml जोड़ने.
- परिवेशी वायु के साथ 37 पर 3 दिनों ° C के लिए सेते हैं.
- BMCs के सक्रियकरण
- तैयार करने के लिए मध्यम BMCs सक्रिय. सक्रियकरण मध्यम बीएमसी मध्यम 100U/ml IFN-γ और 100 एनजी / एमएल LPS के साथ पूरक है. एक पानी के स्नान में LPS 2 मिनट के लिए पहले समुच्चय बाधित उपयोग Sonicate.
- कुओं से बीएमसी मध्यम निकालें और सक्रियण के माध्यम से 1 मिलीलीटर के साथ बदलें.
- 37 में सेते डिग्री सेल्सियस, 5% से 3 दिनों के लिए सीओ 2.
6. Immunofluorescence पता लगाने
- 1X पीबीएस के साथ संक्रमित कुओं तीन बार कुल्ला.
- ठीक 20 मिनट के लिए 3% formaldehyde के 200ul साथ monolayer.
- लगानेवाला निकालें और 1X पीबीएस के साथ कुओं कुल्ला.
- कुओं को 0.1 एम ग्लाइसिन के 200μl जोड़ें और 5 मिनट के लिए बैठते हैं.
- ग्लाइसिन निकालें और 1X पीबीएस के साथ कुओं कुल्ला.
- 3% BSA/0.2% 1X पीबीएस में TritonX-100 के 250 μl जोड़ें permeabilize और 30 मिनट के लिए monolayer ब्लॉक.
- अवरुद्ध समाधान निकालें और 1X पीबीएस के साथ कुओं कुल्ला.
- 3% में rhodamine Dolichos biflorus agglutinin 1:250 कमजोर पड़ने की 50 μl जोड़ें BSA/0.2% ट्राइटन 1X पीबीएस में X-100.
- कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए कवर प्लेट और मंच हिलनेवाला पर जगह
- Coverslips 0.2% के साथ 3 बार धो ट्राइटन 1X पीबीएस में एक मंच हिलनेवाला पर प्रत्येक 5 मिनट के लिए X-100.
- माउंट coverslips VectaShield बढ़ते मध्यम युक्त 4'6 - diamidino 2 - phenylindole (DAPI) का उपयोग.
- सना हुआ टी. gondii rhodamine के लिए एक उपयुक्त फिल्टर के साथ 100x एक magnification पर एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन का उपयोग visualized किया जा सकता .
7. प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 1 टी. के प्रतिनिधि DBA धुंधला से पता चलता है पीएच तनाव के तहत सक्रिय BMMs और HFFs में gondii. परजीवी के आसपास दोनों शो DBA धुंधला vacuoles युक्त, पुटी दीवार घटकों की उपस्थिति का संकेत है. सक्रिय BMM छवि DBA धुंधला हो जाना है कि रिक्तिका की सतह के साथ संगत है पता चलता है. टी. के पार अनुभाग gondii पीएच में बल दिया HFFs कोई आंतरिक दाग संरचनाओं के साथ पुटी दीवार से पता चलता है.
चित्रा 1. पर बल दिया टी. DBA धुंधला gondii तनाव की स्थिति, सक्रिय BMMs या पीएच के तहत intracellular परजीवी HFFs पर बल दिया, rhodamine संयुग्मित DBA (लाल) के साथ दाग थे. अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) पुटी की रूपरेखा से पता चलता है और काले पैमाने पर पट्टी के बराबर होती है 2 सुक्ष्ममापी है.
पशुओं पर प्रयोग
जानवरों पर प्रयोग विश्वविद्यालय के विस्कॉन्सिन पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा निर्धारित दिशा निर्देशों और नियमों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया.
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Discussion
जबकि bradyzoite विकास के तंत्र पूरी तरह समझ नहीं है, टी. के आणविक आनुवांशिक विश्लेषण gondii टिशू कल्चर में मंच रूपांतरण bradyzoite पुटी 2,3,4 गठन में शामिल कर रहे हैं कि जीन की खोज करने के लिए नेतृत्व किया गया है. विश्लेषण भी अवलोकन है कि कुछ bradyzoite मार्करों अन्य सक्रिय 5,6 मैक्रोफेज में वृद्धि सहित लंबे समय से तनाव की स्थिति में व्यक्त कर रहे हैं करने के लिए नेतृत्व . उपर्युक्त विधियों का वर्णन कैसे विकसित करने के लिए टी. gondii और विकास को प्रेरित एक DBA दोनों BMCs और HFFs में सकारात्मक पुटी दीवार संरचना . इन परिणामों पर प्रकाश डाला कि पुटी विकास मार्ग अलग तनाव stimuli द्वारा प्रेरित किया जा सकता है.
क्योंकि टी. gondii आतशमिज़ाज मेजबान से लगभग किसी भी nucleated सेल में विकसित कर सकते हैं, कई प्रकार की कोशिकाओं टी. बढ़ने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है इन विट्रो में gondii. HFFs इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया गया क्योंकि वे कर रहे हैं एक संपर्क सेल लाइन हिचकते. सेल संस्कृति bradyzoite के विकास के बाद से तीन दिन लगते हैं, यह आसान है करने के लिए सेल लाइनों का उपयोग नहीं है कि अधिक बढ़ना होगा. HFFs प्राथमिक कोशिकाओं है कि अनिश्चित काल के सभ्य नहीं कर सकते हैं कर रहे हैं. अब HFFs टिशू कल्चर में passaged हैं, कम सहिष्णु वे उच्च पीएच माध्यम से हो जाते हैं, और इस प्रकार कम व्यर्थ वे bradyzoite स्विचन के लिए एक हो जाते हैं. इष्टतम परिणामों के लिए, मेजबान कोशिकाओं को कम बीतने हो सकता है और मिला हुआ बनने के बाद कम से कम एक सप्ताह आराम करने की अनुमति दी जाना चाहिए. Bradyzoites है कि मेजबान सेल पर 7 अलग प्रभाव के विकास के उत्प्रेरण के लिए वैकल्पिक तरीके हैं.
टी. gondii कई प्रतिरक्षा सेल प्रकार में पनपती. कुछ अनुप्रयोगों के लिए, BMCs सेल लाइनों बृहतभक्षककोशिका बेहतर कर रहे हैं क्योंकि वे कलाकृतियों कि 8 अमरता द्वारा पेश किया गया हो सकता है से बचने. BMCs भी कर रहे हैं इन विट्रो प्रयोगों के लिए उपयोगी है क्योंकि वे एक फ्लैट आकारिकी RAW264.7 कोशिकाओं की तुलना में है, उन्हें और अधिक माइक्रोस्कोपी करने के लिए उत्तरदायी बना. बुनियादी बीएमसी संस्कृति विधि यहाँ वर्णित अन्य प्रयोजनों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, अन्य माउस उपभेदों 9,10 से BMCs के उत्पादन सहित ,. सक्रियण की डिग्री IFNγ और LPS के साथ देखा विक्रेता पर निर्भर करता है अलग और भी बहुत कुछ हो सकता है. यह इसलिए LPS और IFNγ इष्टतम और लगातार प्रदर्शन के लिए सक्रियण के माध्यम में इस्तेमाल की मात्रा टाइट्रेट आवश्यक है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम विस्कॉन्सिन - मैडिसन हरमन मैं शापिरो गणमान्य ग्रेजुएट (CMT) फैलोशिप, एनआईएच AI072817 पुरस्कार (एएमपी) और अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन पुरस्कार 0840059N (LJK) विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया.Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | GIBCO, by Life Technologies | 11960-051 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | heat inactivate |
| Rhodamine Dolichos biflorus agglutinin | Vector Laboratories | RL-1032 | |
| Formaldehyde (16%) | Polysciences, Inc. | 18814 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-1 | |
| IFNγ | PeproTech Inc | 315-05 | Store in single use aliquots |
| L-glutamine (200mM) | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma-Aldrich | L4391-1MG | Store in single use aliquots |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-545-80 12CIR-1 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| RPMI medium 1640 powder (with L-glutamine, without bicarbonate) | GIBCO, by Life Technologies | 31800-022 | |
| Triton-X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | GIBCO, by Life Technologies | 25200 | |
| VectaShield mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |
References
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